【摘要】：人感染甲型H7N9流感病毒是少數(shù)幾種能感染人的甲型流感病毒之一。當(dāng)甲型H7N9流感疫情爆發(fā)時(shí),常規(guī)的流感病毒檢測方法因需要昂貴的大型檢測儀器和高標(biāo)準(zhǔn)的檢測環(huán)境而難以發(fā)揮作用,因此,迫切需要找到一種適用于現(xiàn)場檢測的H7N9甲型流感病毒檢測方法。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas13a蛋白質(zhì)是一種經(jīng)過密碼子優(yōu)化可由原核生物表達(dá)的蛋白質(zhì)。當(dāng)Cas13a通過單鏈引導(dǎo)RNA(crRNA)與靶RNA特異性結(jié)合時(shí),其蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變并產(chǎn)生RNase活性,從而非特異性地降解RNA。利用Cas13a的特性,本文旨在建立一種潛在的H7N9病毒核酸現(xiàn)場檢測方法。主要研究結(jié)果如下:1、對(duì)兩種感受態(tài)大腸桿菌和兩種培養(yǎng)基進(jìn)行組合篩選,然后取大腸桿菌表達(dá)的可溶蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis),經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后使用凝膠成像儀分析各蛋白質(zhì)條帶。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用LB(Luria-Bertan)培養(yǎng)基培養(yǎng)Rosetta 2(DE3)pLysS大腸桿菌表達(dá)LwCas13a蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)比例最高達(dá)到8.27%。分別對(duì)影響大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的各種因素進(jìn)行單因素優(yōu)化,使用控制變量法改變誘導(dǎo)條件,然后對(duì)大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后使用凝膠成像儀分析各蛋白質(zhì)條帶。研究結(jié)果表明,在大腸桿菌指數(shù)生長期OD_(600)值為1.0時(shí),誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的比例最高,達(dá)到5.17%;加入0.1 mM IPTG(Isopropylβ-D-Thiogalactoside)時(shí),誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的比例最高,達(dá)到5.97%;誘導(dǎo)溫度設(shè)置為25℃時(shí),誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的比例最高,達(dá)到7.43%;誘導(dǎo)16小時(shí)時(shí),誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的比例達(dá)到最大為8.13%。使用親和層析法純化LwCas13a時(shí),純化效果較差,有許多雜蛋白質(zhì)存在;使用酶切去親和層析法純化LwCas13a時(shí),純化效果很好,蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后使用凝膠成像儀分析純度很高。2、設(shè)計(jì)兩組陰性對(duì)照驗(yàn)證Cas13a蛋白質(zhì)復(fù)合體的活性和特異性。研究結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組測得熒光值顯著高于兩組陰性對(duì)照,證明Cas13a蛋白質(zhì)復(fù)合體有RNase活性且針對(duì)靶RNA有良好的特異性。參考RNase A間接測量1 IU Cas13a蛋白質(zhì)復(fù)合體,使用二分法測量各組分最適量。研究結(jié)果表明,1 IU Cas13a蛋白質(zhì)復(fù)合體由1.875 pmol Cas13a,2.25 pmol crRNA和64.46 pmol靶RNA組成。在1 IU Cas13a蛋白質(zhì)復(fù)合體的基礎(chǔ)上稀釋Cas13a蛋白質(zhì)和crRNA以確定最佳使用量。研究結(jié)果表明,在20μL檢測體系中,應(yīng)有9.375 nM Cas13a和12.5 nM crRNA,另外加入1μL RNase抑制劑,100 ng人類總RNA,一定量的待檢測RNA和300 nM RNA探針以構(gòu)成檢測體系。3、使用實(shí)時(shí)熒光定量的方法測定提取自H7N9病毒株樣本中表達(dá)HA(hemagglutinin)和NA(nueraminidase)的RNA濃度。研究結(jié)果表明,表達(dá)HA RNA濃度為29.14 fM,表達(dá)NA RNA濃度為819.72 fM。分別使用該已知濃度樣本和標(biāo)準(zhǔn)品RNA評(píng)估檢測體系的最低檢測限及最低檢測時(shí)間。研究結(jié)果表明,該方法能在5 min內(nèi)檢測出1 nM的NA RNA。為提高檢測靈敏度,RT-RPA和T7體外轉(zhuǎn)錄被引入以構(gòu)建新的檢測體系。針對(duì)HA和NA RNA分別設(shè)計(jì)了3組9對(duì)RPA引物,通過篩選確定SX-H3-F+SX-H1-R引物對(duì)和SX-N2-F+SX-N3-R引物對(duì)分別為針對(duì)HA和NA基因的最佳RPA引物。在下游引物5’端加上T7啟動(dòng)子序列并按照RPA試劑盒說明書構(gòu)建新的檢測體系,使用該已知濃度的H7N9 RNA樣本評(píng)估檢測體系的最低檢測限及最低檢測時(shí)間。研究結(jié)果表明,該方法能在30 min內(nèi)檢測出100 aM的NA RNA。使用新的檢測體系對(duì)提取自各種亞型的甲型流感病毒RNA進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果表明,只有H7N9病毒組熒光值顯著升高,證明新檢測體系特異性良好。因此,我們誘導(dǎo)表達(dá)和純化出了有活性的Cas13a蛋白質(zhì),并基于Cas13a蛋白質(zhì)構(gòu)建出了針對(duì)H7N9甲型流感病毒的具有良好靈敏度和特異性的檢測體系。為實(shí)現(xiàn)H7N9甲型流感病毒現(xiàn)場檢測提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

2.2 結(jié)果與分析2.1 質(zhì)粒提取與轉(zhuǎn)化.1.1 質(zhì)粒圖譜質(zhì)粒中含有編碼抗氨芐青霉素的基因，因此可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩養(yǎng)大腸桿菌。表達(dá)目的蛋白 LwCas13a 及標(biāo)簽蛋白的基因由 T7 啟動(dòng)子及縱子調(diào)控。Lac 表達(dá)產(chǎn)物與操縱基因結(jié)合，抑制目的基因進(jìn)行 T7 轉(zhuǎn)錄。乳糖經(jīng) β-半乳糖苷酶催化水解成葡糖糖和乳糖，隨后發(fā)生的副反應(yīng)生產(chǎn)別與阻遏物結(jié)合從而使阻遏物從操縱基因上脫離下來，因此可通過加入誘導(dǎo)這種抑制作用，不被代謝分解的別乳糖類似物 TPTG 效果更佳。在該質(zhì)粒編碼 T7 RNA 聚合酶的基因，因此待轉(zhuǎn)化的大腸桿菌應(yīng)含有編碼 T7 RNA的基因，T7 RNA 聚合酶特異性的識(shí)別并結(jié)合 T7 啟動(dòng)子，催化目的基因 mRNA，進(jìn)而表達(dá)出目的蛋白。目的蛋白是一個(gè)包含 LwCas13a、SUMp-tag II 和 6×His 的蛋白質(zhì)集合。

huLwCas13a 質(zhì)粒電泳圖。M，15000 b取的質(zhì)粒；2，酶切后的質(zhì)粒。f Twinstrep-SUMO-huLwCas13a plasmid. M extracted from E. coli; 2, Double-digested pl結(jié)果如圖 2-2 所示，環(huán)狀質(zhì)粒相對(duì)于線速度慢，其長度不能通過電泳圖像來不一的線狀 DNA。通過電泳圖可以得中被一種酶切割的質(zhì)粒呈線性狀態(tài)，成兩條線狀 DNA，大小符合 5306 bpstrep-SUMO-huLwCas13a 質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)
【學(xué)位授予單位】：長江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;R446.5

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本文編號(hào)：2644109