【摘要】：目的:核酸檢測對于疾病的診斷、療效評估、動態(tài)監(jiān)測至關(guān)重要。Toehold exchange和toehold displacement是廣泛應(yīng)用于核酸生物傳感方法中保證核酸檢測特異性的兩種鏈置換反應(yīng)策略。然而,目前仍缺少對這兩種策略的直接比較以確定哪一種策略更適合臨床核酸檢測。滾環(huán)擴增(RCA)是一種高效的核酸等溫擴增技術(shù),其具有操作簡單、靈敏、快速等特點而在核酸分析中倍受青睞。在本研究中,我們將系統(tǒng)性地比較toehold exchange和toehold displacement兩種鏈置換反應(yīng),以獲得保證核酸檢測高特異性的策略,并嘗試提高鏈置換反應(yīng)效率;探索耦合鏈置換反應(yīng)與RCA技術(shù)用于保證核酸檢測的特異性和靈敏度,建立一種更具通用性的RNA檢測新方法。方法:首先,我們分別在三種不同緩沖溶液(20 mM Tris-HCL(含1M Na~+)、1×PBS(pH 7.4,10 mM PBS)、1×TAE)中系統(tǒng)性地比較了toehold exchange和toehold displacement的檢測特異性,并計算其實驗區(qū)分因子和理論區(qū)分因子。然后,我們提出并證實了"拉動策略",即在toehold exchange反應(yīng)達平衡時,加入新的探針與toehold exchange產(chǎn)物反應(yīng),打破原反應(yīng)平衡,以提高toehold exchange正向反應(yīng)效率從而提高檢測信號。最后,我們以miRNA let-7d為檢測模型,基于溶解轉(zhuǎn)換的發(fā)夾探針耦合toehold exchange和RCA建立了用于RNA檢測的特異性識別和通用性信號放大的熒光傳感方法。結(jié)果:1.Toehold exchange相對于toehold displacement顯示出更高的特異性,其中toehold exchange的實驗DF值為6左右,toehold displacement的實驗DF值為1左右;2."拉動策略",即在toehold exchange反應(yīng)達平衡加入新的探針消耗toehold exchange產(chǎn)物,提高鏈置換正向反應(yīng)效率,將檢測信號提高了2-3倍,而檢測特異性幾乎不變。3.以miRNA let-7d為檢測模型,所建立的RNA檢測方法的線性范圍為1 fM-1 nM,檢測下限為0.46 fM,并能區(qū)分2 nt或3 nt差異的同家族miRNA。結(jié)論:1.Toehold exchange相對于toehold displacement在實驗和理論上均具有更高的平衡特異性,該結(jié)論將為后續(xù)建立核酸特異性檢測方法提供參考與指導(dǎo)。2."拉動策略"將為提高核酸檢測靈敏度提高新的契機,且?guī)缀醪挥绊懞怂崽禺愋浴?.基于溶解轉(zhuǎn)換的發(fā)夾探針耦合toehold exchange和RCA建立了用于RNA檢測的熒光傳感方法,該方法顯示出良好的檢測性能,并且僅需改變檢測探針序列而不需重新設(shè)計RCA模板序列便可用于對其他RNA的檢測,更具通用性。
【圖文】：

14圖 1.1 Toehold displacement 和 toeholdexchange 檢測性能的比較Figure 1.1 Performance comparision of toehold exchange and toehold displacement

體系熒光信號急劇下降，，這是因為稀釋效應(yīng)和鏈置換所導(dǎo)致的猝滅效應(yīng)的疊加（圖 1.2C，右邊）�；趫D1.2C，我們計算出 ΔGsep約為 0.995 kcal mol-1。因此，熒光基團和猝滅基團標記核酸鏈后會增加雜交反應(yīng)的吉布斯自由能，降低了鏈置換反應(yīng)的效率。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R440;TP212.3

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4 龔子清;;高中化學中的“置換反應(yīng)”[J];環(huán)渤海經(jīng)濟w

本文編號：2629141