【摘要】：糖基化是一種常見的蛋白質翻譯后修飾,廣泛參與各項生理活動,如蛋白質折疊、細胞通訊、腫瘤轉移、免疫識別以及微生物入侵等,越來越多的臨床研究證據表明許多疾病或非正常的生理狀態(tài)下,一個或多個蛋白質的糖基化程度和其對應糖鏈結構會發(fā)生改變。而對這些變化進行測定,不僅可以了解某些蛋白質的生理功能并且可以用于疾病的診斷。因此,通過研究N-聚糖的結構及含量的變化來尋找可能的生物標志物已成為當前糖組學研究領域的熱點之一。由于來源廣泛,易于獲取及富含多種不同類型糖蛋白,血清是目前糖組學研究最多的樣品體系。但是由于血清樣品自身組成復雜性,以及蛋白質糖基化性質導致其相對應的聚糖結構的多樣性和微觀不均一性,給血清中低含量N-聚糖的結構及定量分析帶來困難。相較于傳統的分析方法,生物質譜法具有高靈敏度、高通量和抗雜質干擾等優(yōu)點,已成功應用于血清糖組學的研究。但這些基于生物質譜的分析方法依然不太完善,例如糖鏈的富集、純化、標記等,仍需進一步的研究。本文利用生物質譜的優(yōu)勢,采用兩種衍生化技術,首次對豚鼠血清N-聚糖的結構進行了系統研究,并對幾種分析方法進行了比較。將優(yōu)化后的分析方法應用于結直腸癌病人血清及環(huán)境污染物影響人群血清中Ig G的N-聚糖變化研究,找到潛在的生物標志物。具體內容如下:豚鼠作為一種重要的模式生物,常被應用于免疫學,毒理學和藥理學等領域方面研究。針對豚鼠血清中N-聚糖進行分析有助于進一步了解其生理功能。為了增強N-聚糖的質譜響應信號,我們對豚鼠血清中N-聚糖分別進行全甲基化和甲胺化衍生,然后通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-MS)鑒定了31種全甲基化N-聚糖結構和43種甲胺化N-聚糖結構。首次發(fā)現豚鼠血清中的唾液酸化聚糖的唾液酸存在O-乙�；F象。結果表明溫和甲胺化衍生不破壞O-乙�；僖核峤Y構,更適用于唾液酸化聚糖的分析。同時基于納流液相和電噴霧電離質譜聯用(nano LC-ESI-MS)鑒定出54種甲胺化的N-聚糖結構及其相對應的200多個甲胺化的N-聚糖異構體,并通過二級質譜對其結構進行確認。實驗發(fā)現O-乙�；粌H僅能影響N-聚糖同分異構體的數量,而且還能在一定程度上改變該N-聚糖的親疏水性。實驗結果表明盡管nano LC-ESI-MS在鑒定N-聚糖的結構更具優(yōu)勢,但是MALDI-MS由于操作簡便,圖譜易解析,更加適合大規(guī)模血清樣品中N-聚糖分析。結直腸癌是全球發(fā)病率和死亡率排在前三位的常見的消化道惡性腫瘤,因此結直腸癌的臨床診斷變得尤為重要。本章采用上一章建立的MALDI-MS方法對健康人群和結直腸癌病人的血清中的N-聚糖進行分析,其中準確鑒定出64種人血清N-聚糖結構。所得到的質譜數據經歸一化處理后,再通過過t檢驗和受試者工作特征曲線可以確定其中3種帶有核心巖藻糖結構的N-聚糖與結直腸癌密切相關,可以作為良好的結直腸癌標志物。此外,在對癌癥期型分類與N-聚糖變化關系研究中,發(fā)現血清中N-聚糖在結直腸癌I期的變化并不明顯,而在結直腸癌II期、III期和IV期的變化比較顯著,從糖組學的角度佐證了為什么結直腸癌早期不易被診斷。上述結果表明將MALDI-MS應用于篩選N-聚糖標志物,不僅能夠準確鑒定N-聚糖結構并且獲取相應的疾病標志物,還能從機制上了解疾病的發(fā)展。全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)是兩種廣泛存在于自然環(huán)境中常見的有機污染物,均能引起人體出現不良免疫反應,如胸腺細胞和脾細胞數量減少、肝臟增重以及過氧化物酶體增值等。免疫球蛋白(Ig G)是免疫系統主要的功能執(zhí)行者,Ig G的糖基化與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。因此,本章從糖組學的角度,探討Ig G糖基化與不同濃度的PFOS和PFOA在不同人群中的相互作用關系。采用MALDI-MS技術結合甲胺化衍生方法,對受PFOS和PFOA影響的95個成人和95個兒童血清中提取的Ig G的N-聚糖進行研究,鑒定出28種源于Ig G的N-聚糖結構。質譜數據處理與統計分析顯示,成人組有11種跟PFOS和PFOA濃度相關的具有顯著性變化的N-聚糖,而少年組中則出現了12種跟PFOS和PFOA濃度相關的具有顯著性變化的N-聚糖。就N-聚糖結構特征而言,成人組主要表現為高甘露糖基化,巖藻糖基化和唾液酸化程度的變化,而少年組則主要表現為巖藻糖基化和唾液酸化程度的變化。由此可見,PFOS和PFOA的存在與Ig G糖基化密切相關。本章首次從糖組學的角度來揭示PFOS和PFOA對不同人群會產生不同的影響,在發(fā)現與PFOS和PFOA濃度變化具有顯著性相關性的Ig G N-聚糖結構的基礎上,可以在一定程度上詮釋PFOS和PFOA與不同人群人體免疫系統響應的關系。綜上所述,本文將質譜檢測技術應用于生物體內的血清N-聚糖系統性研究,首次獲得了豚鼠血清N-聚糖的完整信息,同時還發(fā)現了極具潛力的結直腸癌N-聚糖標志物,并且首次將糖組學的研究方法應用于分析環(huán)境污染與健康的問題,為更加深入的了解環(huán)境污染的機制提供了新的思路。本論文工作的開展為將來在臨床疾病診斷、藥物開發(fā)以及公共衛(wèi)生領域提供技術手段與理論基礎,具有廣闊的應用前景。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R446.1

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