【摘要】：目的:細(xì)菌性陰道病(Bacterial Vaginosis,BV)是育齡婦女的常見病癥,并伴有潛在的嚴(yán)重副作用,包括早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的增加。隨著微生物組測序技術(shù)的進(jìn)步,對BV復(fù)雜機(jī)制的研究有了新的進(jìn)展,逐漸衍生出了一些新的診斷方法。本研究通過使用12K Flex Real-Time PCR技術(shù)和二代測序技術(shù)(Next Generation Sequencing,NGS)對17例中間型BV、26例細(xì)菌性陰道病患者和19例健康人群進(jìn)行陰道菌群的檢測與分析,對健康人群陰道內(nèi)的優(yōu)勢菌種和BV患者的復(fù)雜菌群構(gòu)成進(jìn)行對比研究。本研究的主要目的是:一是明確BV患者的陰道內(nèi)的病原菌;二是分析中間型BV、BV患者和健康人群的陰道菌群分布差異,以獲得對陰道菌群分布更加全面的、準(zhǔn)確的認(rèn)識,為BV病因的探討和混合感染的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。方法:以2017年8月到2017年12月期間由西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的婦科專家診室的BV患者和正常人為研究對象,取患者的陰道分泌物為實(shí)驗(yàn)樣本,采用陰道微生態(tài)檢測方法診斷BV。(1)采用QuantStudioTM 12K Flex Real-Time PCR檢測技術(shù)對陰道菌群中常見的微生物進(jìn)行物種鑒定;(2)基于V3-V4區(qū)的16S rDNA擴(kuò)增子測序檢測陰道菌群的細(xì)菌多樣性。結(jié)果:(1)健康人群陰道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)相對較為簡單,物種豐富度低,而BV患者的菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜,且物種豐富度遠(yuǎn)高于正常人。(2)PcoA分析顯示中間型BV和BV患者在菌群的分布上差異不大,在屬水平的熱圖分布中,這兩組樣本可以明確的區(qū)分開,同時(shí)健康組與BV組和中間型BV組之間可以清晰的區(qū)分開來。(3)健康組優(yōu)勢菌群主要以乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為主,而BV患者的優(yōu)勢菌群主要以加德納菌屬(Gardnerella)、普雷沃菌屬(Prevotella)、纖毛菌屬(Sneathia)、巨球型菌屬(Megasphaera)、奇異菌屬(Atopobium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、Prevotella_7、支原體屬(Mycoplasma)為主。(4)QuantStudio~(TM) 12K Flex Real-Time PCR檢測技術(shù)與NGS技術(shù)檢測的優(yōu)勢菌群基本一致,且12K Flex Real-Time PCR檢測技術(shù)可以鑒定到種。結(jié)論:QuantStudio ~(TM) 12K Flex Real-Time PCR檢測技術(shù)與NGS技術(shù)這兩種檢測技術(shù)都有自身的優(yōu)勢。但是,12K Flex Real-Time PCR檢測技術(shù)可以具體的鑒定到物種的水平。BV患者的陰道菌群有較高的物種多樣性,菌群構(gòu)成復(fù)雜,且優(yōu)勢菌群以厭氧菌為主;中間型BV與BV患者陰道菌群有顯著性的差異,中間型BV的乳桿菌屬比BV患者豐富度高;健康人群的陰道菌群物種豐富度低,菌群構(gòu)成簡單,主要以乳桿菌屬為主。
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1.2 QuantStudioTM 12K Flex Real-Time PCR System 檢測技術(shù)的概述1.2.1 QuantStudioTM12K Flex Real-Time PCR System 檢測技術(shù)QuantStudioTM12K Flex Real-Time PCR System 檢測系統(tǒng)是由 Thermo FScientific 負(fù)責(zé)研發(fā)的，然后國家微檢測中心進(jìn)行儀器的訂購，其大致操作流程圖如 它采用了 Real-Time PCR 檢測技術(shù)，可以滿足臨床陰道內(nèi)病原微生物的檢測，并且它用全新的工業(yè)設(shè)計(jì)和 OpenArrayTM微流體技術(shù)，可以達(dá)到極高的樣本量和檢測通量QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System 可以進(jìn)行高通量熒光定量 PCR、數(shù)字 功能。此外，QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System 檢測系統(tǒng)可以同時(shí)運(yùn)行 OpenArray plate，一次可檢測 96 個(gè)樣本。該檢測技術(shù)所應(yīng)用到的探針和引物預(yù)先被包在 OpenArray plate 的每個(gè)小孔中，最大程度的降低了人為操作帶來的失誤和環(huán)境的染；每張芯片可發(fā)生 3072 個(gè)反應(yīng)，，每次實(shí)驗(yàn)可允許 4 張芯片同時(shí)反應(yīng)，總反應(yīng)達(dá) 12個(gè)。

圖 2.2 部分樣本、陰性對照、陰道微生物擴(kuò)增指控的擴(kuò)增曲線Fig 2.2 Amplification curves of some samples, negative controls, and Vaginal MicrobiotaAmplification Control注：圖中 A、B、C、D、E 分別是 Mix、Water，nuclease-free、無菌棉簽拭子、TaqManR VaginalMicrobiota Amplification Control、樣本 A7。2.4.4 BV 患者與正常人的病原菌檢出分析BV 患者通過 OpenArray 檢測，發(fā)現(xiàn) BV 患者主要檢出微生物從高到低依次是：陰道加德納菌（Gardnerella vaginalis）、惰性乳酸桿菌（Lactobacillus iners）、陰道阿波托菌（Atopobium vaginae）、普雷沃雙歧桿菌（Prevotella bivia）、解脲支原體（Ureaplasmaurealyticum）、人型支原體（Mycoplasma hominis）、BVAB2、巨型球菌Ⅰ（UnculturedMegasphera 1 ）；正常人群的主要檢出微生物從高到低依次是：惰性乳酸桿菌（Lactobacillus iners）、卷曲乳酸桿菌（Lactobacillus crispatus）、解脲支原體（Ureaplasmaurealyticum）。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R711.31;R446.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 田泉;薛艷;李娜;安瑞芳;;4019例婦科門診不同癥狀患者陰道微生態(tài)狀況分析[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2013年12期

本文編號：2605995