【摘要】：基因治療是一種新型的、通過操控相關(guān)遺傳物質(zhì)來阻礙疾病的發(fā)生和發(fā)展,進(jìn)而達(dá)到治療目的的醫(yī)療手段。而目前基因治療最主要的困難就是缺少一種安全有效的傳遞表達(dá)載體,因為裸露的基因治療藥物(具有特異性表達(dá)的DNA質(zhì)粒)在組織或細(xì)胞中易被核酸酶降解,而且其自身所帶負(fù)電荷與同電荷性質(zhì)的細(xì)胞膜之間相互排斥,導(dǎo)致其被細(xì)胞內(nèi)吞和在內(nèi)涵體中的逃逸能力差,使得基因治療難見成效。靜電紡絲技術(shù)可以連續(xù)性高效制備超細(xì)纖維,利用靜電紡絲制備的納米纖維氈具有均勻多孔結(jié)構(gòu)、比表面積高等優(yōu)點,其獨特的3D結(jié)構(gòu)可以很好地仿生天然細(xì)胞外基質(zhì),為細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)交換及繁殖提供良好的微環(huán)境。過去,靜電紡絲技術(shù)制作基因載體的普遍方法是把具有生物相容性的高聚物溶液與基因藥物直接混合在一起進(jìn)行紡絲,成絲過程中基因藥物必定會暴露在高壓電場和有機溶劑環(huán)境中,這一定會影響基因藥物的生物活性。另外,單純混合紡成的電紡纖維載體中的基因藥物由于分布不勻,包封不完畢,當(dāng)進(jìn)行體外釋放時存在突釋效應(yīng)。樹狀大分子是一種內(nèi)部含有空腔、表面具有大量活性官能團(tuán)的高度對稱性球形大分子,且表面端基的數(shù)量隨著其代數(shù)的增加而呈指數(shù)級增長。由于其表面正電荷密度高,能有效壓縮基因治療藥物且在細(xì)胞內(nèi)涵體內(nèi)具有極強的質(zhì)子緩沖能力而被用作非病毒性基因輸送載體的典型�？紤]到現(xiàn)有靜電紡納米纖維基介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染體系中存在的問題,結(jié)合樹狀大分子作為基因輸送載體的優(yōu)勢,本實驗首次提出將端氨基第五代聚酰胺胺樹狀大分子(G5.NH_2)固定在聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米纖維表面來原位壓縮增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因,并以固定了納米G5.NH_2/pEGFP復(fù)合顆粒的纖維基體作為細(xì)胞培養(yǎng)支架,構(gòu)建一種原位、局部基因轉(zhuǎn)染的復(fù)合基質(zhì)介導(dǎo)傳遞體系。首先,本文采用自制的靜電紡絲裝置,研究了PLGA的濃度和紡絲流速對納米纖維成絲性能的影響,發(fā)現(xiàn)在PLGA濃度為25 wt%、紡絲流量為1 ml/h、施加電壓為20 kv的條件下能紡出粗細(xì)均勻、直徑較小、形貌可觀的納米纖維。然后,采用層層自組裝的方法,將端氨基第五代聚酰胺胺樹狀大分子(G5.NH2)固定在PLGA納米纖維的表面形成纖維基復(fù)合基因輸送體系。掃描電子顯微鏡(SEM)顯示纖維表面形態(tài)及三維多孔結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯變化,但纖維平均直徑有所增加;X射線光電子能譜(XPS)證實在修飾了G5.NH2后譜圖中出現(xiàn)了明顯的氮元素的特征峰,而氮元素的出現(xiàn)證明G5.NH2成功修飾至纖維表面,且修飾效率隨PDADMAC/PAA組裝層數(shù)的增加有所提高。親疏水性測試說明材料經(jīng)組裝、修飾處理后親水性能得到較明顯的改善。后續(xù)的原子力顯微鏡(AFM)檢測則顯示G5.NH2的成功修飾可以大大提高PLGA納米纖維表面的粗糙度,也印證了由于粗糙度的增加,修飾處理后的PLGA納米纖維親水性能得到的改善。最后,選取成纖維細(xì)胞NIH 3T3為模型細(xì)胞,以攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的質(zhì)粒DNA為模型基因藥物,評價負(fù)載了模型基因的納米纖維對細(xì)胞的原位基因轉(zhuǎn)染效率。熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分別定性和定量的分析了復(fù)合納米纖維基的轉(zhuǎn)染效率,說明組裝兩層PDADMAC/PAA的PLGA復(fù)合納米纖維基具有更高的基因轉(zhuǎn)染效率,達(dá)到了3.76%。
【圖文】：

圖 1.1 細(xì)胞鑲嵌在靜電紡納米纖維支架中生長接包裹在基質(zhì)中用于基質(zhì)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，常也很差。通常在 DNA 被基質(zhì)負(fù)載之前，，能有效保護(hù) DNA 免受核酸酶的降解并提03 年，M.Hadjiargyrou 所領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊段共聚物（poly (D,L-lactide)-poly(ethylen載有基因的復(fù)合顆粒，再與紡絲液 PLGAA 負(fù)載在納米纖維中[6]。初步試驗結(jié)果證天，而且釋放時間可以通過改變共聚物各組夠轉(zhuǎn)染培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞（M模式使得轉(zhuǎn)染效率較低。而將細(xì)胞直接在載所處微環(huán)境的局部基因藥物濃度得到提高基質(zhì)介導(dǎo)的局部基因轉(zhuǎn)染的潛力。體

圖 1.2 幾種已商業(yè)化的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)式合物物也是一種較為普及的轉(zhuǎn)染試劑，對 DNA 具有很好的縮合、包覆和運體內(nèi)轉(zhuǎn)染應(yīng)用中不會像脂質(zhì)體那樣有較高的細(xì)胞毒性，因而對其的研究
【學(xué)位授予單位】：武漢紡織大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R450;TQ340.64

【參考文獻(xiàn)】

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1 王虎;路來金;;殼聚糖/PLGA乳化膜預(yù)防雞趾屈肌腱粘連的實驗研究[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2007年06期

2 何創(chuàng)龍,黃爭鳴,張彥中,劉玲,韓曉建,魯亞南;靜電紡絲法制備組織工程納/微米纖維支架[J];自然科學(xué)進(jìn)展;2005年10期

3 郭炳華,張鈞壽,謝躍進(jìn);陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J];藥學(xué)進(jìn)展;2000年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 李韻秋;用于局部基因傳遞的負(fù)載載體/pDNA及載體/shRNA復(fù)合物的膜和微球傳遞系統(tǒng)的研究[D];武漢大學(xué);2010年

2 肖仕麗;靜電紡零價納米鐵/聚合物材料的制備、表征及其環(huán)境修復(fù)應(yīng)用[D];東華大學(xué);2010年

3 周林珠;聚酰胺—胺型樹狀大分子介導(dǎo)基因傳遞的研究[D];華中科技大學(xué);2006年

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1 巫寒冰;綠色工藝制備聚乙烯亞胺衍生物在細(xì)胞支架和介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染中的研究[D];東華大學(xué);2015年

2 賈瑞;共價層層自組裝納濾膜的制備及性能研究[D];中國海洋大學(xué);2014年

3 鄔麗麗;PLGA/殼聚糖電紡復(fù)合膜用于人工皮膚的研究[D];天津大學(xué);2007年

本文編號：2589387