【摘要】：目的:mig-14是沙門菌屬水平轉(zhuǎn)移獲得的毒力基因,在沙門菌入侵宿主和抵抗多粘菌素B(簡稱PB)的殺傷作用等方面有著重要作用,但其具體作用機制尚不明確。本論文旨在研究Mig-14參與傷寒沙門菌抵抗PB殺傷的分子機制。方法:(1)多粘菌素B作用下mig-14基因表達譜分析體外普通LB中加入PB致終濃度為0.1μg/ml,分別培養(yǎng)傷寒沙門菌野生株(WT)和mig-14基因缺陷變異株(△mig-14)5 h(37oC,250 r/min)后,提取WT和△mig-14的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成c DNA并標記熒光(cy3或cy5),與基因組芯片雜交,掃描后據(jù)熒光信號分析各基因轉(zhuǎn)錄表達水平,比較WT和△mig-14在PB作用下的基因表達譜差異;選擇部分差異表達基因進行熒光實時定量RT-PCR分析,驗證DNA芯片分析結(jié)果。(2)WT與△mig-14的Omp C::3×Flag,Omp F::3×Flag標簽融合菌株制備采用自殺質(zhì)粒p GMB151介導的同源片段重組方法,在傷寒沙門菌WT與△mig-14的omp C、omp F基因的終止密碼子前分別插入3×Flag標簽,制備WT-Omp C::3×Flag、WT-Omp F::3×Flag標簽變異菌株,△mig-14-Omp C::3×Flag、△mig-14-Omp F::3×Flag標簽變異菌株。(3)Western Blot免疫印跡法檢測WT和△mig-14中Omp F和Omp C的表達量PB刺激條件下培養(yǎng)WT-Omp C::3×Flag、WT-Omp F::3×Flag標簽變異菌株與△mig-14-Omp C::3×Flag、△mig-14-Omp F::3×Flag標簽變異菌株,收集全菌蛋白,以抗Flag單克隆抗體進行Western Blot免疫印跡分析WT與△mig-14變異株孔道蛋白Omp C、Omp F表達的差異。(4)基因缺陷變異株的制備采用自殺質(zhì)粒介導的同源重組方法制備傷寒沙門菌各基因缺陷變異株。根據(jù)S.Typhi的omp C基因堿基序列,設(shè)計相應引物,并在5′末端加上Bam H I的特異性酶切位點。擴增omp C基因片段,利用粘性末端特性連接成omp C基因的不完全同源性核苷酸片段。膠回收后熱擊入E.coli,篩選陽性質(zhì)粒,然后電轉(zhuǎn)導入傷寒沙門菌野生株WT、omp F缺陷株(簡稱△omp F)(實驗室保存)、mig-14缺陷株(簡稱△mig-14)(實驗室保存),進行同源重組。用PCR觀察重組現(xiàn)象,將相應完全重組的菌株作為omp C基因的缺陷變異株、omp C/omp F、mig-14/omp C雙缺陷變異株(分別簡稱△omp C,△omp C/omp F、△mig-14/omp C)。將本實驗室保存的含omp F同源缺失片段的陽性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至△mig-14和△mig-14/omp C,進行同源重組,制備mig-14/omp F及mig-14/omp C/omp F三缺陷變異株(分別簡稱為△mig-14/omp F、△mig-14/omp C/omp F),并通過PCR及序列分析鑒定技術(shù)加以確定。(5)各菌株抵抗PB殺傷能力分析以橫坐標為培養(yǎng)時間,OD600吸光度值為縱坐標繪制生長曲線,對比各個基因缺陷變異株與野生株在PB殺傷作用下的生存情況。(6)Mig-14對生物膜形成能力的影響把野生株、△mig-14、△mig-14(空p BAD)、△mig-14回補株分別培養(yǎng)至OD6000.6后取等量的菌放置96孔板30oC靜置培養(yǎng)3天后,甲醇30分鐘固定,結(jié)晶紫對生物膜染色,用乙酸溶解后酶標儀測定OD570紫外吸收值,紫外吸收值代表生物膜生成量,比較傷寒沙門菌WT與△mig-14生物膜生成能力。結(jié)果:(1)PB刺激下Mig-14基因表達譜分析基因表達譜比較分析結(jié)果表明,與野生株相比傷寒沙門菌mig-14基因缺陷變異株在PB刺激5小時后,有768個基因表現(xiàn)出明顯的表達差異。其中,鞭毛相關(guān)基因、外膜孔道蛋白相關(guān)基因omp C、omp F表達上調(diào)、侵襲和毒力相關(guān)基因表達下調(diào)。RT-PCR驗證結(jié)果顯示,與基于DNA芯片的基因表達譜分析數(shù)據(jù)相比,兩者變化情況趨勢一致。(2)WT與△mig-14的Omp C::3×Flag,Omp F::3×Flag標簽融合菌株制備經(jīng)PCR及序列分析證實成功在傷寒沙門菌WT與△mig-14缺陷株的omp C、omp F基因終止密碼子前插入3×Flag標簽,成功制備WT-Omp C::3×Flag,WT-Omp F::3×Flag融合標簽變異株以及△mig-14-Omp C::3×Flag,△mig-14-Omp F::3×Flag融合標簽變異株。(3)Western Blot免疫印跡法分析WT和△mig-14中Omp F和Omp C的表達差異Western-bolt結(jié)果顯示,相比于WT在PB刺激下△mig-14的孔道蛋白Omp C,Omp F表達量明顯增多。(4)基因缺陷變異株的制備經(jīng)序列鑒定技術(shù)分析證實成功構(gòu)建傷寒沙門菌△omp C、△omp C/omp F、△mig-14/omp C、△mig-14/omp F、△mig-14/omp C/omp F變異株。(5)各菌株抵抗PB殺傷能力分析結(jié)果顯示△mig-14生存能力明顯弱于WT,而且△mig-14/omp F、△mig-14/omp C及△mig-14/omp C/omp F生存能力強于△mig-14。(6)Mig-14對傷寒沙門菌生物膜形成能力的影響生物膜試驗結(jié)果顯示△mig-14缺陷的情況下,相比于WT生物膜形成能力降低。結(jié)論:PB刺激條件下,傷寒沙門菌Mig-14可調(diào)節(jié)多種基因的表達。mig-14缺失后,omp C及omp F的表達上調(diào)。在mig-14缺失的基礎(chǔ)上缺失omp F或omp C后,傷寒沙門菌在PB刺激條件下的生存能力有所提高,但并未達到野生株水平。本研究進一步發(fā)現(xiàn)Mig-14可促進生物膜的形成。綜上所述,Mig-14可能通過改變細菌膜的滲透性及促進生物膜的形成以抵制PB的殺傷作用。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R440

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本文編號：2583130