【摘要】：本論文由兩部分組成,第一部分是細胞膽固醇代謝與造血干細胞的增殖分化研究,第二部分是短時高溫致紅細胞損傷的機制研究。第一部分:目的通過pLKO.1-NPC1/NPC2 shRNA重組慢病毒感染EML(erythroid myeloid lymphoid,EML)細胞獲得NPC1、NPC2基因沉默的EML細胞模型,進而探討NPC1、NPC2對EML細胞增殖分化的影響。方法通過NPC1 shRNA、NPC2 shRNA重組慢病毒感染EML細胞獲得NPC1、NPC2基因有效沉默的EML細胞模型。利用該模型以Filipin染色檢測NPC1、NPC2基因敲低后對EML細胞內膽固醇分布的影響,以CCK-8和臺盼藍染色進行增殖檢測,以流式細胞術檢測NPC1、NPC2基因沉默后EML細胞干性標志物CD34、sca-1、c-kit及TER-119、CD11b、B220的改變,利用Western blot分析SCF刺激細胞后c-kit磷酸化的改變。結果成功構建NPC1、NPC2基因沉默的EML細胞模型,NPC1、NPC2基因在mRNA和蛋白水平表達均顯著降低(P0.01)。NPC1、NPC2敲低的EML細胞中出現(xiàn)膽固醇蓄積,且在NPC1敲低的EML細胞模型中膽固醇蓄積更顯著。沉默NPC1、NPC2基因后使得EML細胞增殖減慢(P0.01),并且能夠降低EML細胞CD34、sca-1和TER-119、B220的陽性率(P0.01)。經SCF刺激后NPC1基因沉默的EML細胞中c-kit的磷酸化降低顯著(P0.01),但在NPC2基因沉默的EML細胞中c-kit磷酸化的改變并無統(tǒng)計學差異。結論膽固醇轉運相關基因NPC1通過調節(jié)細胞膽固醇流動參與了EML細胞的增殖和分化調控。造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是機體具有組織特異性的一群細胞,為了維持正常的造血功能其可通過不對稱分裂(asymmetric division)在調節(jié)自身數(shù)量穩(wěn)定的同時生成多系和/或單系造血祖細胞(hematopoietic progenitor cells,HPCs)。正常生理情況時,機體HSCs的含量和各系造血祖細胞的數(shù)量維持在一個動態(tài)平衡的狀態(tài)。當這個穩(wěn)定平衡狀態(tài)被打破,HSCs的量急劇增多或哪一系或多系造血祖細胞數(shù)量發(fā)生顯著改變都將引發(fā)疾病。究其機制,過去大量的研究主要聚焦在免疫系統(tǒng)。近年來,有研究顯示細胞內膽固醇的流出對HSCs和HPCs穩(wěn)態(tài)維持起著重要作用。三磷酸腺苷結合蛋白ABCA1和ABCG1通過把HSCs和HPCs內膽固醇轉運至高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)而將其運出細胞,當ABCA1和ABCG1缺失時上述膽固醇轉運途徑障礙,將使得造血祖細胞恢復造血功能,同時出現(xiàn)髓外造血。此外,巨核細胞祖細胞(megakaryocyte progenitor cells,MPCs)內膽固醇外流障礙將引發(fā)血小板增多綜合征,與ABCG1高度同源的三磷酸腺苷結合轉運蛋白ABCG4在巨核細胞祖細胞中的缺失將使得胞內膽固醇轉運至HDL障礙,進而引發(fā)細胞膜促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)受體(c-MPL)表達增多,最終引發(fā)疾病。在動脈粥樣硬化的小鼠在體模型中載脂蛋白E(apo lipoprotein E,ApoE)通過影響ABCA1和ABCG1的功能而調節(jié)細胞內膽固醇流出進而調控HSCs增殖且與單核細胞增多相關。除此之外,NPC1、NPC2基因在膽固醇流出細胞的過程中同樣起著關鍵作用。NPC1基因的缺失將引發(fā)以膽固醇轉運障礙為特征的尼曼匹克病(NPC1),患者主要表現(xiàn)為神經元的大量膽固醇聚集和神經功能障礙,同時患者也存在造血功能障礙,但是機制不清楚,還需要探討。為了探索NPC1、NPC2基因調節(jié)造血干細胞生物學特性,特別是增殖和分化特征,本課題以造血干細胞系EML(erythroid myeloid lymphoid)作為模型,通過基因表達分析、基因功能分析研究NPC1、NPC2基因對EML細胞增殖和分化的調控及其機制。首先我們根據(jù)EML細胞干性標志sca-1不同水平的表達,通過細胞流式技術分離sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low 3個細胞亞群,檢測各亞群細胞中NPC1和NPC2基因的表達,分析NPC1、NPC2基因表達與EML細胞干性的關聯(lián)。其次,通過基因沉默技術敲降(knock-down)EML細胞NPC1和NPC2基因,分析NPC1和NPC2對EML細胞增殖和分化的影響。最后,通過分析NPC1和NPC2基因對SCF介導c-kit磷酸化的影響,探討NPC1和NPC2調節(jié)細胞增殖分化的機制。本研究得到的主要結果有:在EML細胞中NPC1和NPC2基因的表達與sca-1呈正相關。利用NPC1、NPC2基因慢病毒成功構建了NPC1、NPC2基因敲低的EML細胞模型。Filipin染色結果顯示,與對照相比,在NPC1和NPC2基因沉默的EML細胞中膽固醇顯著蓄積,且NPC1基因沉默的EML細胞中膽固醇蓄積更顯著。NPC1、NPC2基因沉默的EML細胞生長明顯慢于對照細胞(P0.01),表明NPC1和NPC2基因參與了EML細胞的增殖調控。同時,NPC1、NPC2基因沉默的EML細胞CD34和sca-1的陽性率顯著降低(P0.01),提示NPC1、NPC2沉默以后能夠使EML細胞的分化能力降低。在幾種細胞中粒系標志物CD11b所占比例均較低,且差異無統(tǒng)計學意義,說明NPC1、NPC2基因敲低后對EML細胞向粒系的分化并無影響;而在NPC1沉默的EML細胞中TER-119所占比例顯著低于其余3種細胞(P0.01),說明NPC1基因的沉默能夠抑制EML細胞向紅系分化;B220所占比例在NPC1、NPC2基因沉默的EML細胞中顯著降低(P0.01),表明沉默NPC1、NPC2基因能夠抑制EML細胞向淋巴系分化。SCF刺激細胞后,NPC1基因沉默的EML細胞c-kit磷酸化受到明顯抑制(P0.01),但在NPC2基因沉默的EML細胞中c-kit的磷酸化改變并無統(tǒng)計學差異。提示,NPC1基因參與了EML細胞c-kit的磷酸化調控。利用細胞膽固醇轉運阻斷劑U18666A、細胞膜膽固醇剝離劑beta-CD、游離膽固醇處理EML細胞后發(fā)現(xiàn),經U18666A、beta-CD處理后EML細胞c-kit的磷酸化顯著降低(P0.01),與NPC1基因沉默對c-kit磷酸化的影響一致;并且,當聯(lián)合使用beta-CD和膽固醇處理后相較于前者,EML細胞c-kit的磷酸化有所升高(P0.01),提示NPC1對SCF介導的EML細胞c-kit磷酸化的影響是通過改變細胞膜膽固醇含量實現(xiàn)的。第二部分:紅細胞(Red blood cells,RBC)是哺乳動物血液中數(shù)量最多的血細胞,RBCs除了是氧氣運輸?shù)闹饕浇檫�是重要的免疫細胞。RBCs生成于骨髓,在體內,新生的RBCs平均壽命為120d,并將經歷輕齡、中齡、老齡3個階段,最終衰老的RBCs被機體免疫系統(tǒng)清除,或是在經過肝臟時被枯否細胞(Kupffer Cells)分解為膽汁。但在病理狀態(tài)下RBCs的衰老死亡將加劇。細胞生物學研究發(fā)現(xiàn),高溫能夠引起細胞質膜變形,形成凸起狀泡。在一定程度上,泡的形成是自適應的,從而增加細胞的存活率。但是細胞受熱越嚴重起泡程度越大,并且細胞死亡率越高。廣泛的數(shù)據(jù)顯示,高熱、熱射病時體溫升高治療不及時或治療不完善將導致紅細胞減少甚至貧血,但究其機制還尚不清楚,亟待進一步研究。為了觀察短時高溫引起紅細胞結構和功能的變化,探討高熱(中暑)引起紅細胞損傷的機制。本研究取健康志愿者的靜脈血,分別在37℃(對照組)和42℃(實驗組)下孵育10 min,Percoll密度梯度離心法分離不同細胞年齡的紅細胞,測定其Zeta電位值,分析不同年齡紅細胞所占比例的改變;同時,我們利用流式細胞儀檢測細胞大小、細胞凋亡以及紅細胞內活性氧(ROS)的變化,探討高溫對紅細胞衰老、凋亡的影響。本研究得到的主要結果有:與37℃相比,42℃下實驗組的紅細胞表面電荷顯著降低(P0.05),紅細胞體積顯著減小(P0.05),凋亡顯著增加(P0.05),細胞內ROS顯著增加(P0.05)。最終發(fā)現(xiàn),短時高溫能引起紅細胞理化性質的改變,進而導致紅細胞衰老、凋亡加劇,這可能是急性高熱(中暑)引起血液系統(tǒng)病理改變的機制。
【圖文】：

19A-B: 流式分選 EML 細胞 sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low 各亞細胞群；C-D:q-PCR 檢測 EML細胞 sca-1-high、sca-1-inter、sca-1-low 亞細胞群基因 NPC1、NPC2 的表達，1：EML/sca-1-high，2：EML/sca-1-inter，3：EML/sca-1-low;；a：P＜0.01，，與 sca-1-high, sca-1-inter 比較圖 1 EML 細胞 NPC1、NPC2 基因的表達與 sca-1 的相關性分析2.5 討 論NPC1、NPC2 基因編碼的蛋白主要分布于細胞溶酶體，在細胞內膽固醇轉運過程中起著重要作用。NPC1 和可溶性膽固醇結合蛋白 NPC2 共同作用，將細胞攝取和合成的膽固醇從 LE/Ly 轉運到內質網(wǎng)、胞漿膜和其他細胞器膜[6]。其中分布于細胞膜的膽固醇是構成細胞膜脂質筏的主要成分，能夠維持脂質筏結構和功能的完整。脂質筏是細胞膜上含有眾多信號分子的微區(qū)，介導了多條信號通路的轉

34細胞 NPC1 和 NPC2 基因的表達 a:P＜0.01, 與各細胞NPC1和NPC2基因編碼蛋白的表達水平：EML/NPC2shRNA；C：半定量分析 n=3, a:P＜圖 3 NPC1 和 NPC2 基因沉默的 EML 細胞驗證
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R457.7

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 劉廷析;劉廷析;;造血干細胞研究進展[J];生命科學;2009年05期

本文編號：2546462