【摘要】：阪崎克羅諾桿菌是一類條件致病菌。其危害的人群為新生兒、嬰幼兒及老年人,由該菌引發(fā)的癥狀包括小腸結(jié)腸炎、敗血癥、腦膜炎和菌血癥,具有較高的致死率。因此,建立快速靈敏的檢測方法對于該菌的預(yù)防與控制具有重要的意義。本研究基于8株阪崎克羅諾桿菌(CICC22922, CICC21560, 90905, ATCC29004,ENS6607,ATCC12868,ENS70307-2, ENS07208)已經(jīng)鑒定出來的 59 個具有免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)點,篩選出特異性較高的2個外膜蛋白點。將最終篩選出來的這兩個特異性蛋白,結(jié)合該蛋白三維結(jié)構(gòu),找出特異性強的膜外氨基酸序列并找到編碼它們的核苷酸序列,分別為基因A和基因B,長度分別為138 bp、132 bp。通過PCR驗證其屬內(nèi)覆蓋性和屬外特異性。由于基因片段太短因此通過柔性肽將兩段特異性基因片段重復連接,序列經(jīng)公司合成后連接到載體PUC57,通過雙酶切構(gòu)建pET-26b(+)重組表達質(zhì)粒。在大腸桿菌BL21中進行了重組蛋白的誘導及表達優(yōu)化,獲得分子量約為22 kDa的融合蛋白A和分子量約為20 kDa的融合蛋白B。將2種重組蛋白進行大規(guī)模重組表達并親和純化獲得了目的蛋白后,分別免疫新西蘭白兔和SPF雞,制備多克隆抗體。利用純化的雞源多抗(IgY)和兔源多抗(IgG)對阪崎克羅諾標準菌株進行雙抗夾心ELISA檢測。初步建立并優(yōu)化了雙抗夾心ELISA法:以蛋白A雞源多抗(A-IgY)為捕獲抗體,包被量為0.5μg,蛋白A兔源多抗(A-IgG)為檢測抗體,抗體稀釋倍數(shù)為200倍,封閉液為溶于PBS的1%的脫脂乳粉,酶標二抗稀釋倍數(shù)為20000倍。對建立的雙抗夾心ELISA方法進行評價,檢測限為1.5×107 CFU/mL,定量限為3.9×107 CFU/mL。板內(nèi)變異為1.69%-4.62%,板間變異為4.12%-7.4%。用此方法檢測3株不同的阪崎克羅諾桿菌、5株不同種的克羅諾桿菌和6株非克羅諾桿菌屬的菌株,結(jié)果表明該檢測方法對克羅諾桿菌具有較好的特異性。
【圖文】：

證明Ａ特異性基因在中的覆蓋率較高。在３０株Ｃ．逡逑菌株中利用ＰＣＲ驗證基因Ｂ的特異性，結(jié)果顯示只有＃３０號（ＥＮＳ５３２９）、＃３２號逡逑（ＥＮＳ５１０２４－２）菌株中沒有出現(xiàn)特異性條帶（圖３－２），其余菌株中均擴出了邋Ｂ特異性基因逡逑片段，證明Ｂ特異性基因片段在中的覆蓋率也較高。逡逑Ｍ邋０１２邋３邋６＂９邋Ｖｉｓｉｏｎ邋２６２８邋３０邋３２３３３５邋３６３７３Ｓ３９４０邋４１４２４３４６邋４？邋４Ｓ４９５０邋３１邋５２逡逑邐ＨＩＭ）邐＾邋＾邋－邋．邋．邋邋邋＊邋…、－■．ｗ。、＇．ａ．邋…．逡逑�。珏义蠄D３－１邋ＰＣＲ驗證Ａ基因在阪崎克羅諾桿菌中的覆蓋性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｖｅｒａｇｅ邋ｏｆ邋Ｇｅｎｅ－Ａ邋ｉｎ邋ｃｒｏｎｂａｃｔｅｒ邋ｓａｋａｚａｋｉｉ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ標準ＤＬ２０００；０．空白對照；１－５２．實驗室菌株編號逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ２０００；邋Ｏ．邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋１－５２．邋Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｎｕｍｂｅｒ逡逑ＭＯｌ邋２３邋６邋’邋９邋ｒｉＳ２０邋２２邋２６邋２８３０３２３３邋３￥邋３６３７邋３Ｓ３９４０４１４２邋４３邋４６４￣

證明Ａ特異性基因在中的覆蓋率較高。在３０株Ｃ．逡逑菌株中利用ＰＣＲ驗證基因Ｂ的特異性，結(jié)果顯示只有＃３０號（ＥＮＳ５３２９）、＃３２號逡逑（ＥＮＳ５１０２４－２）菌株中沒有出現(xiàn)特異性條帶（圖３－２），其余菌株中均擴出了邋Ｂ特異性基因逡逑片段，證明Ｂ特異性基因片段在中的覆蓋率也較高。逡逑Ｍ邋０１２邋３邋６＂９邋Ｖｉｓｉｏｎ邋２６２８邋３０邋３２３３３５邋３６３７３Ｓ３９４０邋４１４２４３４６邋４？邋４Ｓ４９５０邋３１邋５２逡逑邐ＨＩＭ）邐＾邋＾邋－邋．邋．邋邋邋＊邋…、－■．ｗ。、＇．ａ．邋…．逡逑�。珏义蠄D３－１邋ＰＣＲ驗證Ａ基因在阪崎克羅諾桿菌中的覆蓋性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｖｅｒａｇｅ邋ｏｆ邋Ｇｅｎｅ－Ａ邋ｉｎ邋ｃｒｏｎｂａｃｔｅｒ邋ｓａｋａｚａｋｉｉ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ標準ＤＬ２０００；０．空白對照；１－５２．實驗室菌株編號逡逑Ｍ．邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ２０００；邋Ｏ．邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋１－５２．邋Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｎｕｍｂｅｒ逡逑ＭＯｌ邋２３邋６邋’邋９邋ｒｉＳ２０邋２２邋２６邋２８３０３２３３邋３￥邋３６３７邋３Ｓ３９４０４１４２邋４３邋４６４￣
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R446.6

【參考文獻】

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本文編號：2541073