發(fā)布時間：2019-05-07 06:17

【摘要】：疾病的早期診斷是目前臨床醫(yī)學面臨的巨大挑戰(zhàn)之一,發(fā)展靈敏度高、簡單快速以及便攜的生物診斷新方法尤為重要。近年來,DNA納米技術(shù)和無機納米材料的快速發(fā)展,為發(fā)展新型的生物診斷方法提供了新的思路。SERS光譜具有峰窄、靈敏度高、抗光漂白、不受生物樣本自發(fā)熒光干擾以及能夠快速實時原位檢測的特點,被廣泛應(yīng)用于生物分析和成像中。電化學檢測具有靈敏度高、快速、廉價以及易于集成等特點也得到生物傳感器的青睞。本文就結(jié)合生物納米材料和SERS以及電化學檢測手段主要做了以下四個方面的工作。1.“即用型”多色金-銀納米蘑菇SERS探針用于超靈敏和多元的核酸檢測合成具有強而穩(wěn)定的表面增強拉曼散射(SERS)信號的含銀金屬納米結(jié)構(gòu)對于開發(fā)用于生物檢測的超靈敏探針具有很大的前景。然而,直接合成“即用型”納米探針仍然是非常具有挑戰(zhàn)性的。在這里我們合成了DNA介導的含有納米空隙的金銀納米蘑菇,并將之用于多種DNA和RNA的同時檢測。納米結(jié)構(gòu)中的DNA不僅可以作為間隙DNA(介導的DNA),而且可以作為探針DNA(雜交DNA),并且具有識別DNA和RNA靶標的能力。重要的是,我們建立了生成多色SERS探針的兩種不同策略。第一,將拉曼分子標記的巰基DNA組裝在金納米顆粒上;第二將拉曼分子與探針DNA共同組裝在金納米顆粒上。這種“即用型”SERS探針也為開發(fā)各種生物分子的超靈敏檢測方法提供了巨大的潛力。2.多元甲基化特異的酶連核苷酸分析(MS-ELONA)方法用于DNA甲基化的定量研究癌癥相關(guān)基因啟動子甲基化的變化在致癌過程中起著重要作用,DNA甲基化具有早期癌癥診斷的潛力。我們構(gòu)建了MS-ELONA方法用于DNA甲基化的多元和高靈敏度檢測。首先用甲基化特異的引物去擴增亞硫酸氫鹽處理的DNA,然后將PCR產(chǎn)物固定在絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)上。在超過10萬倍的未甲基化等位基因存在的情況下,我們可以檢測到2 pg的甲基化DNA。我們還通過用去甲基化藥物處理癌細胞來檢測藥物對DNA甲基化的可逆修飾,并能夠用于篩選抗腫瘤藥物以及可用作腫瘤標志物的甲基化DNA。結(jié)合自主研發(fā)的16通道電化學工作站以及16通道絲網(wǎng)印刷電極,我們的研究提供了一種簡單,便宜和多元的平臺用來量化特定基因的甲基化水平,并有潛力應(yīng)用于臨床研究中。3.基于智能手機的電化學生物傳感器用于血清中外泌體即時檢測以及監(jiān)測外泌體的分泌外泌體是由哺乳動物細胞主動分泌的納米級囊泡,其攜帶者親代細胞的遺傳信息,在細胞間通訊起著重要作用。外泌體也可以作為潛在的生物標志物,可用于癌癥診斷和術(shù)后預測。在這里,我們結(jié)合智能手機開發(fā)了一種超靈敏和便攜式電化學方法定量分析外泌體。利用基于聚合物HRP的信號放大,只需要5μL樣本,我們就可以在2小時內(nèi)檢測到7.23 ng外泌體。我們還可以直接捕獲5μL血清中的外泌體和細胞培養(yǎng)上清液。利用CD63陽性外泌體檢測系統(tǒng),我們的研究發(fā)現(xiàn)CD63在前列腺患者血清中外泌體的表達較少,對前列腺癌的診斷具有廣闊的應(yīng)用潛力。此平臺也可以用于監(jiān)測藥物治療后癌細胞外泌體的分泌,并有潛力用于現(xiàn)場測定。4.基于DNA四面體的碳基電化學傳感檢測平臺與多種類分子診斷近年來隨著納米科學與技術(shù)的發(fā)展,納米材料修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極由于具有制備簡單,價格低廉,容易集成等優(yōu)點已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于電化學生物傳感領(lǐng)域中,在環(huán)境,衛(wèi)生,食品,診斷等領(lǐng)域中展現(xiàn)了其廣闊的應(yīng)用前景,因此構(gòu)建基于絲網(wǎng)印刷碳電極的簡易且通用的電化學檢測平臺尤為重要。目前由于絲網(wǎng)印刷碳電極具有較為粗糙的表面,易產(chǎn)生非特異性吸附,以及探針方向不可控等缺陷,基于絲網(wǎng)印刷碳電極的核酸檢測平臺的研究較少,這極大的限制了其在核酸研究中的應(yīng)用。本文首次報道了利用DNA四面體修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極通用平臺,其可以解決碳界面的缺陷,并且能夠應(yīng)用于多種生物活性分子的檢測。通過簡單的共價偶聯(lián)就能將DNA四面體固定在碳界面上,制作工藝簡單,通過改變DNA四面體延伸出來的探針序列就可以用于不同的靶標分析中。在這里我們設(shè)計了gap雜交,“三明治夾心”以及核酸適配體遞減策略分別用于mi RNA141,凝血酶以及ATP的檢測,具有較高的信噪比以及檢測靈敏度和特異性。此外,DNA四面體絲網(wǎng)印刷碳電極通用檢測平臺能夠成功應(yīng)用于血清樣本中。因此,具有高信噪比的DNA四面體通用碳納米生物傳感界面極大的拓展了其在核酸研究中的應(yīng)用并且具有應(yīng)用于臨床疾病診斷的潛力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(上海應(yīng)用物理研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R446;TB383.1

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本文編號：2470834