【摘要】：沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,CT)是嚴(yán)格活細(xì)胞內(nèi)寄生、且具有獨特的發(fā)育周期的微生物。通過性傳播感染泌尿生殖道,可引起女性盆腔炎、宮外孕和不孕不育等,引起學(xué)者高度關(guān)注。CT感染開始于原體(EB)進(jìn)入宿主細(xì)胞,在胞漿液泡內(nèi)(包涵體)迅速分化成網(wǎng)狀體又稱始體(RB),RB復(fù)制后分化成EB感染相鄰細(xì)胞。CT的整個生物合成過程是在包涵體內(nèi)完成的,為了維持自身發(fā)育生長,CT需通過包涵體膜與宿主細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換與信息傳遞。在此過程中,包涵體膜發(fā)揮很重要的生物學(xué)作用。包涵體膜蛋白(inclusion membrane protein,Inc)是包涵體的重要組成成分,由衣原體基因編碼,具有特異性的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),Inc的N末端和C末端均在宿主細(xì)胞漿,N末端具有III型分泌信號,C末端至少具有兩個跨膜螺旋親水區(qū)域。當(dāng)RB形成時,Incs可通過III型分泌系統(tǒng)(T3SS)分泌表達(dá),對于衣原體的生長、發(fā)育發(fā)揮重要的作用,故對于Incs的研究尤為重要。目前推測CT有多于50個假定的包涵體膜蛋白。其中,CT813是被預(yù)測并經(jīng)過證實的包涵體膜蛋白之一,初步研究揭示其在CT感染的泌尿系統(tǒng)疾病的女性中具有免疫原性并可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng),但CT813的具體生物學(xué)功能尚不清楚。為此,我們對CT813進(jìn)行了進(jìn)一步研究,前期實驗運用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與CT813相互作用的分子,包括環(huán)腺苷酸應(yīng)答原件結(jié)合蛋白3(CREB3)、半乳糖凝集素-1(LGALS1)、核糖體蛋白L10a(RPL10a)和微管蛋白37E-16(RP1-37E16)。本研究采用細(xì)胞共定位技術(shù)與免疫共沉淀技術(shù)對CT813與CREB3分子間是否存在相互作用做進(jìn)一步鑒定。首先,根據(jù)Genbank中CT813與CREB3的核酸序列設(shè)計引物,分別擴增目的片段CT813與CREB3,構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813與pcDNA3.1+/Flag-CREB3,采用雙酶切、菌落PCR、基因測序?qū)ι鲜鲋亟M載體進(jìn)行驗證。其次,運用亞細(xì)胞共定位技術(shù)驗證CT813與外源性的CREB3間是否存在相互作用。將重組表達(dá)載體pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813與pcDNA3.1+/Flag-CREB3共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞(實驗組),同時將pcDNA3.1+/Myc-His A空質(zhì)粒與pcDNA3.1+/Flag-CREB3(對照組)共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,經(jīng)過24h,固定(丙酮)、封閉(山羊血清)、一抗孵育(小鼠抗Myc單克隆抗體,兔抗CREB3單克隆抗體)、洗滌、二抗孵育(羊抗小鼠IgG-Cy3抗體,羊抗兔IgG-FITC抗體)、避光洗滌、染核(DAPI)、避光洗滌、封片(抗熒光淬滅劑封片),在激光共聚焦顯微鏡下觀察,結(jié)果表明實驗組中CT813顯有紅色熒光,CREB3顯有綠色熒光且二者間發(fā)生重疊,重疊部分為黃色熒光;對照組中,CREB3顯現(xiàn)綠色熒光,其與標(biāo)簽Myc沒有發(fā)生重疊,實驗組與對照組的結(jié)果CT813與外源性CREB3存在相互作用。再次,運用免疫共沉淀技術(shù)驗證CT813與外源性的CREB3間是否存在相互作用。將重組表達(dá)載體pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813與pcDNA3.1+/Flag-CREB3(實驗組)共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,將pcDNA3.1+/Myc-His A空質(zhì)粒與pcDNA3.1+/Flag-CREB3,共轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,將pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞(對照組),經(jīng)過48 h后將細(xì)胞裂解(冰上裂解30 min),離心,吸附(上清用Anti-c-Myc agarose吸附)、洗滌、制備樣品、Western blot檢測(電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體、洗滌、孵育二抗、洗滌、ECL發(fā)光);未轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞裂解后做β-actin的Western blot檢測(β-actin對照組)。結(jié)果顯示:實驗組中在33 kD與46 kD處分別具有條帶,大小與CT813、CREB3的分子量相符;對照組中,空質(zhì)粒與pcDNA3.1+/Flag-CREB3共轉(zhuǎn)染組無條帶,pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813轉(zhuǎn)染組在33 kD處出現(xiàn)條帶;β-actin組在43 kD即處有條帶。由上說明CT813與外源性CREB3發(fā)生相互作用。最后,運用亞細(xì)胞共定位技術(shù)驗證CT813與內(nèi)源性的CREB3間是否存在相互作用。CREB3是亮氨酸拉鏈c AMP反應(yīng)結(jié)合蛋白家族內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),故選取內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣聯(lián)結(jié)蛋白(calnexin)作為參照。將HeLa細(xì)胞進(jìn)行固定(丙酮)、封閉(山羊血清)、一抗孵育(小鼠抗calnexin單克隆抗體,兔抗CREB3單克隆抗體)、洗滌、二抗孵育(羊抗小鼠IgG-Cy3抗體,羊抗兔IgG-FITC抗體)、避光洗滌、染核(DAPI)、避光洗滌、封片(抗熒光淬滅劑封片),在激光共聚焦顯微鏡下觀察,顯有紅色熒光的calnexin與顯有綠色熒光的CREB3,且二者間發(fā)生重疊,即重疊部分為黃色熒光,進(jìn)一步印證CREB3是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的。將pcDNA3.1+/Myc-His A-CT 813重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞(實驗組),經(jīng)過24h,固定(丙酮)、封閉(山羊血清)、一抗孵育(小鼠抗Myc單克隆抗體,兔抗CREB3單克隆抗體)、洗滌、二抗孵育(羊抗小鼠IgG-Cy3抗體,羊抗兔IgG-FITC抗體)、避光洗滌、染核(DAPI)、避光洗滌、封片(抗熒光淬滅劑封片),在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果表明,實驗組中CT813顯有紅色熒光,CREB3顯有綠色熒光,且二者間發(fā)生重疊,重疊部分為黃色熒光,提示CT813與內(nèi)源性CREB3具有相互作用。綜上,通過運用亞細(xì)胞定位技術(shù)與免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步確證了CT813的確可與CREB3發(fā)生作用。這為進(jìn)一步探究沙眼衣原體CT813蛋白的生物學(xué)功能,從而為闡明沙眼衣原體的致病機制以及防治研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R440

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2465265