【摘要】：研究背景造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)是指通過大劑量放射治療(簡稱放療)和化學治療(簡稱化療)預處理,清除受者原有的造血/免疫系統(tǒng),再通過輸入自體或異體造血干細胞,使受者重建正常造血及免疫系統(tǒng)。HSCT是一種成功的器官移植模式,根據(jù)來源不同,可分為自體移植和異基因移植。異基因HSCT是目前多數(shù)惡性血液病、某些實體腫瘤和遺傳性疾病患者唯一的根治手段[1.3]。HSCT后,絕大多數(shù)移植并發(fā)癥和死亡發(fā)生于造血和免疫重建之前,快速、穩(wěn)定的造血重建是免疫重建最基本、最關鍵的一步,所以,造血系統(tǒng)快速、有效地重建意義重大,可直接影響移植患者的生存率和生存質(zhì)量。目前,細胞治療主要采用靜脈輸注途徑,細胞在到達靶組織前會首先分布在整個身體內(nèi)。例如,在HSCT后的第一個20 h內(nèi),只有(1.56±0.32)%的造血細胞歸巢至骨髓,絕大多數(shù)的移植細胞會首先滯留在肺循環(huán)、肝臟和脾臟中——顯然,造血細胞歸巢至骨髓是其重建造血系統(tǒng)的前提,提高細胞靶向植入骨髓的效率可以提高移植的效果。盡管眾多研究者們曾經(jīng)嘗試使細胞定向遷移至靶組織,但并未突破細胞移植效率低的難題。究其原因,骨具有特定的解剖結構和生理環(huán)境,若僅依靠微環(huán)境中的各種因子、受體的調(diào)節(jié)和趨化作用等,輸入骨組織的移植細胞很難在有效時間內(nèi)在骨髓內(nèi)歸巢、聚集并在“造血龕位”中發(fā)育生長。如何高效地實現(xiàn)細胞的靶向植入?本課題組率先提出了磁力誘導細胞靶向移植(Magnetism-induced cell target transplantation, MagiC-TT)這一細胞治療新策略并獲得國家基金(基金號：30901367)。MagiC-TT——首先使細胞獲得磁性,再在靶器官(如骨髓)局部短期施加一個適宜參數(shù)的磁場,磁化的細胞進入靶器官后,會被吸引在局部并定植下來,此時再撤去磁場,細胞可繼續(xù)增殖、分化或遷移至其它部位。MagiC-TT通過減少細胞遷移至靶組織的時間,以及增加供體細胞在靶器官的局部濃度來提高細胞植入的效率。HSCT中最重要的細胞包括造血干/祖細胞(Hematopoietic Stem/Progenitor Cells, HS/PCs)及參與形成造血微環(huán)境的間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells-MSCs)。HS/PCs是干細胞研究與應用領域中開展最早,也是迄今研究最為深入的一種成體干細胞,其在HSCT、基因治療、免疫治療及體外制備血液產(chǎn)品等方面有著極其重要的價值。而MSCs是一種成熟的、成纖維樣多能細胞,來源于發(fā)育早期的中胚層,能夠分化成脂肪細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞、軟骨細胞和成骨細胞等。MSCs還能夠遷移至靶器官或靶組織,且分泌大量的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凋亡、促血管生成、趨化因子等生物活性分子,因此在眾多疾病的治療中有廣泛的用途。故本課題分別采用HS/PCs和MSCs,研究MagiC-TT對干細胞靶向移植的作用。研究目的1、在體外,以Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化RFP-MSCs,比較研究磁化對RFP-MSCs生物學特性的影響；2、在體內(nèi),以MagiC-TT介導磁化RFP-MSCs植入小鼠骨髓,探討其骨髓靶向移植的效果及對RFP-MSCs在體內(nèi)分布與存活的影響；3、在小鼠自體HSCT模型中,以MagiC-TT介導磁化HS/PCs靶向植入骨髓,探討其對造血重建的影響。研究內(nèi)容第一部分Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化RFP-MSCs及MagiC-TT介導磁化細胞體外靶向遷移的研究[方法](1)使用Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化紅熒光蛋白基因修飾的間充質(zhì)干細胞(red fluorescent protein gene modified mesenchymal stem cell, RFP-MSCs),分選磁化細胞并測定細胞磁化陽性率；(2)比較研究磁化和野生型RFP-MSCs的細胞形態(tài)、增殖、分化及免疫表型等,探討Fe3O4@PDA@Au納米顆粒的生物安全性和相容性；(3)探究在外加磁場條件下,磁化和野生型RFP-MSCs的細胞遷移(垂直、水平、逆重力遷移和生長的)能力；(4)體外分離小鼠股骨,分為磁化細胞組和對照組,分別注射經(jīng)新霉素耐藥基因和熒光素酶基因修飾的磁化RFP-MSCs (NeoR-Luc-RFP-MSCs)和未磁化的NeoR-Luc-RFP-MSCs,通過生物發(fā)光成像系統(tǒng)觀察兩組熒光細胞隨磁場位置變化而遷移的情況。[結果](1)Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化RFP-MSCs陽性率為(85.36±1.24)%。(2)磁化和野生型RFP-MSCs在細胞形態(tài)、增殖、分化及免疫表型方面無差異；納米顆粒位于RFP-MSCs細胞表面及細胞內(nèi)； (3)在外加磁場條件下,磁化NeoR-Luc-RFP-MSCs具有定向遷移能力,而未磁化NeoR-Luc-RFP-MSCs則無；(4)通過生物發(fā)光成像系統(tǒng),可觀察到磁化細胞組的NeoR-Luc-RFP-MSCs可隨著磁場的位置移動。[小結]本部分實驗證明：Fe3O4@PDA@Au納米顆粒具有良好的生物安全性和相容性；在體外,MagiC-TT法可成功地實現(xiàn)磁化細胞的定向遷移及生長,為體內(nèi)實驗奠定基礎。第二部分MagiC-TT介導Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化的細胞對骨髓靶向移植的效果及對細胞體內(nèi)分布與存活的影響[方法](1)NeoR-Luc-RFP-MSCs體內(nèi)實驗：野生型BALB/c小鼠隨機分為磁場組(M組)和對照組(C組),每組4只,分別經(jīng)股骨注射磁化的NeoR-Luc-RFP-MSCs,使用生物發(fā)光儀觀察兩組小鼠體內(nèi)熒光在不同時間點的變化；(2)RFP-MSCs體內(nèi)實驗：20只增強綠色熒光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)轉(zhuǎn)基因C57BL/6雌性小鼠,均隨機分為M組和C組(每組10只),在X線引導下股骨穿刺,向兩組小鼠股骨骨髓腔中注射經(jīng)Fe3O4@PDA@Au納米顆粒磁化的RFP-MSCs,但分別加與不加磁場(M組和C組)；通過流式細胞術、熒光定量PCR、病理切片和自創(chuàng)的半固體脫鈣(semi-solid decalcification, SSD)技術,研究細胞在體內(nèi)的骨髓靶向移植效果,以及細胞在體內(nèi)的分布和存活。[結果](1)小動物活體成像儀結果顯示,在細胞注射后5 min時,C組的RFP-MSCs在肺臟開始聚集,股骨處熒光逐漸減弱；而M組的熒光可局限在小鼠的股骨處,若在固定磁場1h后撤去磁場,5 min后M組小鼠肺臟出現(xiàn)熒光,15 min時熒光達到高峰； (2)普通冰凍切片、流式細胞術、熒光定量PCR和SSD技術觀察結果顯示,M組的骨髓中可見大量的RFP-MSCs;而C組小鼠骨髓中則很少見到RFP-MSCs,細胞主要分布在肺、肝、脾等臟器中；(3)病理技術尤其是SSD處理后的病理學檢查,清晰地顯示了移植后骨髓內(nèi)紅/綠熒光細胞(即供、受者細胞)的位置、形態(tài)及相互作用關系等；(4)磁化的RFP-MSCs可以在兩組小鼠不同的器官和組織中存活至少3個月。[小結]本部分實驗表明：(1)在M組小鼠體內(nèi),MagiC-TT法可成功地實現(xiàn)磁化RFP-MSCs的靶向遷移,而在早期撤去M組小鼠的磁場后,磁化細胞可在體內(nèi)遷移； (2)RFP-MSCs在C組小鼠體內(nèi)主要分布在肺、肝、脾等臟器中,骨髓中分布較少；(3)磁化細胞在小鼠體內(nèi)未見明顯毒性,可在體內(nèi)長期存活。第三部分MagiC-TT法介導造血干/祖細胞在小鼠自體HSCT模型中促進造血重建的研究[方法](1)移植細胞數(shù)量梯度實驗：60只C57BL/6受者雌性小鼠,隨機分為6組,每組10只小鼠,分別經(jīng)股骨移植(5×106、1×106,1×105的3個梯度)和尾靜脈移植(5×106、1×106,1×105的3個梯度)造血干/祖細胞。各組小鼠移植前經(jīng)7.5 Gy直線加速器進行清髓性放療,觀察各組生存率等,確定后續(xù)使用的移植細胞數(shù)量。(2)造血干/祖細胞股骨靶向移植實驗：34只C57BL/6雌性普通小鼠作為受者,隨機分為2組,每組17只,兩組小鼠經(jīng)7.5 Gy清髓性放療后,分別于右側(cè)骨髓腔中輸注0.02 ml經(jīng)磁化的來源于GFP C57BL/6小鼠的造血干/祖細胞懸液(1×106)/只,并分別于右側(cè)股骨外加磁場(M組)或不加磁場(C組),一定時間后撤去。流式細胞術檢測細胞輸注后不同時間點(0h、24 h、72 h)處死的兩組小鼠(各3只),比較左右股骨中GFP+細胞數(shù)量和比例有無統(tǒng)計學差異：觀察兩組剩余小鼠(每組8只)的一般情況、血常規(guī)變化、外周血GFP+細胞嵌合率等,并使用病理切片、SSD、熒光定量PCR法等探究GFP+細胞的體內(nèi)分布等。[結果](1)移植細胞數(shù)量梯度實驗：尾靜脈移植組,輸注5×106個細胞的小鼠6/10只存活,輸注1×106和1×105個細胞的小鼠均死亡；而股骨移植組中,輸注5×106個細胞的小鼠均存活,輸注1×106個細胞的小鼠2只存活,1×105的小鼠均死亡；根據(jù)實驗結果,以后實驗中每只小鼠移植1×106個細胞。(2)造血干／祖細胞股骨靶向移植實驗：①M組和C組小鼠于清髓性放療后體重進行性下降,精神狀態(tài)欠佳,1周后部分小鼠體重、精神、活動逐漸恢復。②2組小鼠的生存情況分別為：M組7/8小鼠的生存時間30d；而C組小鼠30d時存活1/8只,平均生存時間(12.43±5.13)d,兩組小鼠生存有統(tǒng)計學差異(P0.05)。③兩組小鼠造血基本恢復時,外周血中GFP+比例分別為(94.10±1.97)%和93.82%,表明HSCT造血重建成功。④細胞輸注后0h、24h、72h,流式檢測兩組小鼠左右股骨中GFP+造血干/祖細胞結果顯示：a.組內(nèi)比較：M組小鼠各時間點股骨中GFP+細胞比例,均是注射細胞側(cè)股骨多于對側(cè)股骨(P0h=0.040, P24h=0.030, P72h=0.049);而C組各時間點的GFP+細胞比例在注射細胞側(cè)與對側(cè)股骨無顯著統(tǒng)計學差異(P0h=0.184, P24h=0.184, P72h=0.368)。b.組間比較：注射細胞側(cè)股骨中的GFP+細胞比例,M組小鼠在三個時間點均多于C組,且有顯著統(tǒng)計學差異(Poh=0.007, P24h=0.006, P72h=0.036);而比較M組和C組的對側(cè)股骨GFP+細胞比例則無顯著統(tǒng)計學差異(P0h=1.000, P24h=0.083, P72h=0.108).⑤ M組小鼠血小板恢復時間較C組快(12.33±2.42) d vs (16.38±2.39) d,P=0.009;且M組小鼠移植后血紅蛋白的最低值較C組高(43.75±13.02) g/L vs (13.75±5.18) g/L,P0.001。⑥病理技術尤其是SSD體系處理后的病理學檢查,清晰地顯示了移植后骨髓內(nèi)供受者細胞的位置、形態(tài)及相互作用關系等,M組小鼠細胞注射側(cè)股骨內(nèi)可見大量GFP+細胞,而C組則很少。[小結]本部分實驗采用eGFP熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠同基因HSCT的模型,探討了MagiC-TT對小鼠移植后造血恢復的影響。結果表明MagiC-TT能夠?qū)崿F(xiàn)磁化造血干／祖細胞的股骨靶向移植,可縮短移植后小鼠造血恢復時間,提高了生存率。全文總結本實驗采用自創(chuàng)的MagiC-TT技術及Fe3O4@PDA@Au NPs新型納米磁化顆粒,通過RFP-MSC的體內(nèi)、外實驗及HS/PCs小鼠同基因HSCT實驗,探究了MagiC-TT對干細胞體內(nèi)分布的作用及對造血恢復的促進作用,并通過SSD等技術平臺,探討了靶向移植后細胞的歸巢、增殖和相互作用等機制,從而為MagiC-TT技術的進一步發(fā)展打下了堅實基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R457.7

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 羅鵬;胡江天;;細胞超微結構的觀察及力學調(diào)控研究進展[J];口腔生物醫(yī)學;2013年03期

2 侯輝光;;細胞超微結構和功能淺述[J];人民軍醫(yī);1984年01期

3 ;長春新堿對細胞超微結構的影響[J];中國醫(yī)學科學院學報;1982年01期

4 李新人,吳馥梅,趙長清,李紹珠,黃金生;強噪聲對小鼠生殖細胞超微結構的影響[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;1984年05期

5 金鎮(zhèn)敬,許淑華,吳振鐸,李富華;急性早幼粒細胞型白血病緩解前后的細胞超微結構觀察[J];哈爾濱醫(yī)科大學學報;1985年03期

6 楊恬;細胞超微結構立體計量法[J];第三軍醫(yī)大學學報;1986年S1期

7 黃飛駿;廖志鋼;彭雪梅;董培正;;小鼠死后肝細胞超微結構的掃描電鏡觀察[J];法醫(yī)學雜志;1992年01期

8 鄭麗杰，王曉璐，，劉翠東，葉青;肺心病急性加重期紅細胞超微結構的觀察[J];中國老年學雜志;1995年06期

9 王仁鵬,張金海;淺談電子顯微鏡技術與細胞超微結構教學模式[J];四川解剖學雜志;1997年01期

10 王鍵,李凈,許冠蓀,陳柯,胡聞;腦絡通對大鼠局灶性腦缺血腦細胞超微結構的影響[J];中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志;1999年01期

相關會議論文 前10條

1 王學斌;楊興易;林兆奮;趙良;周乃勝;;貝科能對心肺復蘇后大鼠心、腦、腎細胞超微結構的保護作用[A];第十一次全國急診醫(yī)學學術會議暨中華醫(yī)學會急診醫(yī)學分會成立二十周年慶典論文匯編[C];2006年

2 陳細法;;免疫抑制劑對漿細胞超微結構和功能影響的觀察[A];海峽兩岸電子顯微學研討會論文專集[C];1992年

3 陳瑩;李承晏;;藍舌病毒湖北株對膠質(zhì)瘤U251細胞產(chǎn)生溶癌效應的實驗研究[A];第九次全國神經(jīng)病學學術大會論文匯編[C];2006年

4 姜巧珍;王宇一;其木格;;人腎旁神經(jīng)節(jié)小強熒光(SIF)細胞超微結構觀察[A];第二屆全國掃描電子顯微學會議論文集[C];2001年

5 劉健;范海霞;楊梅云;余學芳;;佐劑關節(jié)炎大鼠行為、腦組織氨基酸及神經(jīng)細胞超微結構的變化及新風膠囊對其的影響[A];全國第七屆中西醫(yī)結合風濕病學術會議論文匯編[C];2008年

6 謝寶生;賀亮;黃偉芬;吳斌;由廣興;路盛強;;+Gx作用對大鼠腦組織能量代謝和腦皮層細胞超微結構的影響[A];中國宇航學會航天醫(yī)學工程專業(yè)委員會、中國空間科學學會空間生命專業(yè)委員會聯(lián)合學術研討會論文摘要集[C];2001年

7 沈留成;;陽萎患者陰莖海綿體平滑肌細胞超微結構的研究[A];新編男科理論與臨床——中華中醫(yī)藥學會第七屆中醫(yī)男科學術大會;全國中醫(yī)男科臨床與科研方法高級研修班;2006年云南省中醫(yī)男科診療技術培訓班講義與論文集[C];2006年

8 譚峰;萬賽英;吳�？�;霍綺雯;王金良;陳文霖;方美鳳;劉曉林;孫景波;成家茂;;電針對高血壓大鼠腦缺血neurocan-mRNA表達與細胞超微結構的影響[A];國家中醫(yī)藥管理局腦病重點研究室建設研討會暨中風病科研成果推廣交流會論文匯編[C];2010年

9 丁素菊;黎佳思;;通心絡對缺血大鼠腦細胞超微結構及線粒體呼吸功能的保護作用[A];第九次全國神經(jīng)病學學術大會論文匯編[C];2006年

10 靳翠紅;巫生文;劉秋芳;馬健飛;蔡原;;放線菌素D處理V79細胞后CM誘導旁觀者效應的實驗研究[A];中國毒理學會放射毒理專業(yè)委員會第七次、中國毒理學會免疫毒理專業(yè)委員會第五次、中國環(huán)境誘變劑學會致突專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致畸專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致癌專業(yè)委員會第二次全國學術會議論文匯編[C];2008年

相關博士學位論文 前10條

1 馮媛媛;Shox2介導HCN4基因修飾犬MSCs定向分化心臟起搏樣細胞的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

2 潘少輝;牛皮膚源Muse細胞的分離鑒定及其核移植胚胎體外發(fā)育潛能的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

3 姚陳果;可控陡脈沖對惡性腫瘤細胞不可逆性電擊穿的實驗和機理研究[D];重慶大學;2003年

4 石英愛;RNA干涉HeLa細胞端粒酶對其細胞生物學行為的影響及其作用機制的研究[D];吉林大學;2007年

5 江閏德;A549細胞超微結構體視學研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

6 張琰君;左旋苯甲酰脯氨醇自由基的細胞毒性及其分子機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2011年

7 李黎;消癌解毒方對H22荷瘤小鼠和人肝癌SMMC-7721細胞的影響及機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2013年

8 郭輝;姜黃素對雄激素依賴性及雄激素非依賴性前列腺癌細胞的誘導凋亡作用[D];華中科技大學;2006年

9 丁沖;穩(wěn)恒磁場對細胞電磁特性和生物學效應的影響[D];西北工業(yè)大學;2014年

10 葉韻斌;Grb2抑制劑peptidimer-c抗K_（562）細胞的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 黃皓;MagiC-TT介導干細胞靶向植入骨髓對細胞體內(nèi)分布和造血重建影響的研究[D];南方醫(yī)科大學;2016年

2 程亞增;CMV侵染煙草的細胞學觀察及表達譜分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2016年

3 李夢姣;藍萼甲素對人肺癌A549細胞的抑制作用及其機制[D];蘇州大學;2013年

4 王勇;二甲基亞砜對貧鈾誘發(fā)人支氣管上皮細胞損傷的保護機制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2006年

5 孫大林;養(yǎng)精膠囊提取液對Leydig細胞睪酮合成的影響及機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2012年

6 徐玲玲;穩(wěn)恒磁場與抗腫瘤藥物聯(lián)合作用對腫瘤細胞殺傷效應的研究[D];陜西師范大學;2008年

7 劉曉暉;溫度和銅對鯉魚肝臟細胞超微結構的影響[D];東北師范大學;2006年

8 鄭末;工頻均勻強磁場對體外培養(yǎng)SNU細胞影響的研究[D];河北醫(yī)科大學;2004年

9 丁雅明;中晚期小鼠胚胎與惡性腫瘤細胞H_（22）相互作用的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2008年

10 何海濱;番荔枝內(nèi)酯單體Desacetyluvaricin對乙肝相關肝癌細胞TLR4、P53蛋白表達的影響[D];暨南大學;2008年

本文編號：2355660