發(fā)布時間：2018-11-14 11:30

【摘要】：背景:銅綠假單胞菌作為自然界中常見的細菌,也是醫(yī)院外科手術(shù)常見的感染病原體之一。臨床現(xiàn)象表明銅綠假單胞菌在傷口感染時會形成綠色的膿液,從而誘發(fā)敗血癥、呼吸道感染以及尿路感染等。敗血癥主要發(fā)生于人體大面積燒傷以及心臟手術(shù)等,患者常伴有休克或者凝血等癥狀,患者皮膚上會出現(xiàn)壞死性膿包,通常會在患者的血管內(nèi)有菌栓的形成;呼吸道感染最為常見的為借助機械呼吸而誘發(fā)的呼吸機相關(guān)性肺炎;截肢患者會因為置入導(dǎo)尿管而誘發(fā)尿路感染,長期使用抗生素治療同樣會誘發(fā)患者發(fā)生假單胞菌的感染。皮膚感染銅綠假單胞菌常見于機體受到損害而又潮濕的部位,例如嬰兒的臍帶周圍、機體的燒傷部位以及潮濕的腳趾間等。在正常人體內(nèi)發(fā)病率較低,當人體受到外界因素影響而導(dǎo)致抵抗力降低時,該菌可誘發(fā)嚴重的或者致死性的感染。目的:利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)建立了銅綠假單胞菌的一種快速檢測方法。方法:以銅綠假單胞菌gbca基因為模板,采用電腦在線引物設(shè)計的方法,來設(shè)計LAMP引物,利用反應(yīng)體系的顏色變化及瓊脂糖凝膠電泳的差異,檢測分析銅綠假單菌,采用LAMP和PCR的方法同時檢測不同菌株,考察LAMP方法的特異性和靈敏度。結(jié)果:本研究針對銅綠假單胞菌中的gbca基因設(shè)計LAMP序列,建立了銅綠假單胞菌的LAMP檢測方法。與傳統(tǒng)的PCR相比,LAMP不需要將DNA從樣本中純化出來,因此可以較為快速的應(yīng)用臨床樣本的檢測。但不可否認,LAMP技術(shù)也有一定的缺陷,例如相對于PCR而言,LAMP技術(shù)需要設(shè)計4條引物,其設(shè)計要求相對較高,同時,一旦有非特異性擴增的出現(xiàn),會直觀的反應(yīng)在梯度條帶上,誤導(dǎo)樣本的鑒別,而對于LAMP較為靈敏的特點,實驗過程中較容易受到污染。為了更為直觀的考察建立的LAMP方法對銅綠假單胞菌鑒定的適用情況,本研究還在反應(yīng)體系中加入HNB染料,通過顏色變化來判定LAMP技術(shù)檢測銅綠假單胞菌gbca基因,并對該方法的靈敏度以及特異性進行了考察。從實驗結(jié)果能夠看出:(1)顏色變化以及凝膠電泳的結(jié)果顯示,只有銅綠假單胞菌的gbca基因在LAMP方法下發(fā)生了擴增反應(yīng),其他對照菌株沒有發(fā)生LAMP擴增,說明該方法的特異性較好。(2)LAMP擴增結(jié)果顯示與染料組凝膠電泳的結(jié)果一致,可以成功地檢測在8.7 pg/ul濃度時銅綠假單胞菌的總DNA,而PCR法只能檢測到濃度為87pg/ul的銅綠假單胞菌的總DNA,說明LAMP的檢測靈敏度是PCR的10倍左右。同時采用LAMP和PCR檢測臨床收集的21份銅綠假單胞菌標本,其它10例對照菌也同樣平行檢測,結(jié)果表明LAMP和PCR的檢出率是一致的(21/21),兩種方法均未出現(xiàn)假陽性事件。結(jié)論:LAMP方法在檢測銅綠假單胞菌時具有特異性強、靈敏度高等特點,適合于醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)的推廣。
[Abstract]:Background: Pseudomonas aeruginosa, as a common bacterium in nature, is also one of the common infectious pathogens in hospital surgery. Clinical manifestations show that Pseudomonas aeruginosa can form green pus in wound infection, which can induce sepsis, respiratory tract infection and urinary tract infection. Septicemia mainly occurs in human body extensive burn and heart surgery, patients often have shock or coagulation symptoms, the skin of patients will appear necrotic purulent, usually in the blood vessel of patients with bacterial thrombus formation; Respiratory tract infection is the most common type of ventilator-associated pneumonia induced by mechanical respiration. Amputation patients will cause urinary tract infection because of catheter placement. Long-term use of antibiotics will also induce pseudomonas infection. Pseudomonas aeruginosa is commonly found in damaged and moist parts of the body, such as around the umbilical cord, burns, and between wet toes. The incidence of the disease is low in the normal human body. When the body is affected by external factors and the resistance is reduced, the bacteria can induce severe or fatal infection. Objective: to establish a rapid detection method for Pseudomonas aeruginosa by ring-mediated isothermal amplification. Methods: using the gbca base of Pseudomonas aeruginosa as the template, the LAMP primers were designed by computer on-line primer design. Using the color change of the reaction system and the difference of agarose gel electrophoresis, the Pseudomonas aeruginosa was detected and analyzed. LAMP and PCR were used to detect different strains at the same time, and the specificity and sensitivity of LAMP method were investigated. Results: in this study, the LAMP sequence of gbca gene in Pseudomonas aeruginosa was designed, and the LAMP detection method for Pseudomonas aeruginosa was established. Compared with the traditional PCR, LAMP does not need to purify DNA from the samples, so it can be used to detect clinical samples more quickly. But it is undeniable that LAMP technology also has some defects. For example, compared with PCR, LAMP technology needs to design 4 primers, and the design requirements are relatively high. At the same time, once non-specific amplification occurs, it will react intuitively on the gradient band. The identification of misleading samples is more sensitive to LAMP, and it is easy to be contaminated in the process of experiment. In order to investigate more intuitively the applicability of the established LAMP method to the identification of Pseudomonas aeruginosa, HNB dyes were added to the reaction system to detect the gbca gene of Pseudomonas aeruginosa by LAMP technique. The sensitivity and specificity of the method were investigated. The results showed that: (1) the results of color change and gel electrophoresis showed that only the gbca gene of Pseudomonas aeruginosa was amplified by LAMP method, but no LAMP amplification was found in other control strains. (2) the results of LAMP amplification were consistent with those of dye group gel electrophoresis, and the total DNA, of Pseudomonas aeruginosa could be detected successfully at the concentration of 8.7 pg/ul. The total DNA, of Pseudomonas aeruginosa with concentration of 87pg/ul detected by PCR showed that the sensitivity of LAMP was about 10 times that of PCR. At the same time, 21 samples of Pseudomonas aeruginosa were detected by LAMP and PCR. The results showed that the detection rate of LAMP and PCR was the same (21 / 21). There were no false positive events in both methods. Conclusion: the LAMP method has the characteristics of high specificity and high sensitivity in the detection of Pseudomonas aeruginosa, and is suitable for the popularization of medical and health institutions.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R446.5

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本文編號：2331037