【摘要】：基因改造的1型單純皰疹病毒(HSV-1)載體在腫瘤溶瘤病毒治療及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究報(bào)道一種基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的高效快速的重組HSV-1載體構(gòu)建方法。首先,雙順反表達(dá)靶點(diǎn)g DNA和Cas9核酸酶的基因編輯質(zhì)粒與同源重組模板質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后,用親本株感染細(xì)胞;然后,Cas9對(duì)胞內(nèi)病毒基因組定點(diǎn)切割,誘導(dǎo)外源基因同源重組,修復(fù)至病毒基因組指定位點(diǎn)。通過PCR、Western印跡、免疫熒光等方法證明,相比于傳統(tǒng)自發(fā)同源重組的構(gòu)建方法,該方法能顯著提升病毒重組率(4.1%vs 1.1%)。同時(shí),本研究建立了一種新的單克隆病毒純化方案,簡(jiǎn)化了陽(yáng)性病毒篩選步驟。本研究結(jié)果提供了一種高效快速的重組HSV-1構(gòu)建方法,這對(duì)于HSV-1相關(guān)基因治療及其病理機(jī)制研究將具有重要意義。
[Abstract]:The modified herpes simplex virus (HSV-1) vector has been widely used in the treatment and gene transduction of tumor oncolytic virus. This paper reports an efficient and fast construction method of recombinant HSV-1 vector based on CRISPR-Cas9 system. Firstly, the gene editing plasmid of double cis-reverse expression target g DNA and Cas9 nuclease was co-transfected with homologous recombinant template plasmid into Vero cells and infected with parent strain. Then Cas9 cleans the genome of the virus and induces the homologous recombination of the foreign gene to the designated site of the virus genome. At the same time, a new method of monoclonal virus purification was established to simplify the screening of positive viruses. The results of this study provide an efficient and rapid method for construction of recombinant HSV-1, which will be of great significance for the study of HSV-1 related gene therapy and its pathological mechanism.
【作者單位】： 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究(昆醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng))(No.2015FA006,2015FB055,2017FE468)~~
【分類號(hào)】：Q78;R450

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本文編號(hào)：2296719