【摘要】：目的:測(cè)定替加環(huán)素等抗菌藥物對(duì)產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌的最低抑菌濃度(MIC),將蒙特卡洛模擬與PK-PD模型結(jié)合,評(píng)價(jià)替加環(huán)素和米諾環(huán)素治療產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌感染的臨床療效:測(cè)定替加環(huán)素、米諾環(huán)素與氨基糖苷類抗菌藥物對(duì)產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌的體外聯(lián)合抗菌作用;測(cè)定替加環(huán)素等抗菌藥物的單藥和聯(lián)合防耐藥突變濃度(MPC)、耐藥突變選擇窗(MSW),評(píng)價(jià)替加環(huán)素與其他抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用限制耐藥發(fā)生的能力;建立大鼠組織籠感染模型,在體內(nèi)初步驗(yàn)證聯(lián)合用藥療效及限制耐藥發(fā)生能力:對(duì)耐藥突變菌株進(jìn)行鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等研究,探索替加環(huán)素聯(lián)合氨基糖苷類抑制耐藥發(fā)生的可能機(jī)制。方法:(1)采用瓊脂平板稀釋法測(cè)定替加環(huán)素等抗菌藥物對(duì)68株產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌的MIC,并結(jié)合臨床替加環(huán)素和米諾環(huán)素的PK數(shù)據(jù),計(jì)算不同MIC時(shí)的PK/PD參數(shù),再根據(jù)療效判定折點(diǎn)值,利用蒙特卡洛模擬計(jì)算不同劑量下的達(dá)標(biāo)概率(PTA)和總體療效——累計(jì)反應(yīng)分?jǐn)?shù)(CFR)。(2)參照棋盤法設(shè)計(jì),采用微量肉湯稀釋法測(cè)定替加環(huán)素、米諾環(huán)素與阿米卡星、慶大霉素對(duì)不同敏感類型菌株的聯(lián)合MIC和部分抑菌濃度指數(shù)(FICI):采用時(shí)間-殺菌曲線法,動(dòng)態(tài)觀察體外兩種抗菌藥物聯(lián)用對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響,判斷聯(lián)合用藥的協(xié)同性。采用瓊脂平板稀釋法測(cè)定替加環(huán)素、多黏菌素E及阿米卡星單藥和聯(lián)合用藥的MPC,計(jì)算單藥及聯(lián)合的MSW,分析單藥MSW與聯(lián)合用藥MSW的相關(guān)性。(3)建立大鼠組織籠感染模型,分別給予不同劑量的替加環(huán)素和阿米卡星單藥、聯(lián)合用藥治療,觀察給藥7天后組織籠內(nèi)細(xì)菌量、耐藥突變頻率、MIC等變化,測(cè)定耐藥突變菌株的生長(zhǎng)曲線。(4)對(duì)體外篩選的耐藥突變菌株進(jìn)行鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析不同抗菌藥物壓力下篩選的耐藥突變菌株轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異,利用PCR測(cè)定臨床及體外篩選菌株四環(huán)素類和氨基糖苷類耐藥基因,利用RT-PCR測(cè)定替加環(huán)素和米諾環(huán)素耐藥突變菌株外排泵基因acrB及其調(diào)控基因ram4的表達(dá)情況,通過流式細(xì)胞儀測(cè)定氨基糖苷類耐藥突變菌株細(xì)胞膜電位變化情況。結(jié)果:(1) 68株產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌對(duì)美羅培南、頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南均耐藥;多黏菌素E敏感率為97%;替加環(huán)素按不同折點(diǎn)判定的敏感率差別較大,MIC50和MIC90分別為1mg/L和2mg/L;米諾環(huán)素敏感率為50%;氨基糖苷類中阿米卡星的敏感率要高于慶大霉素,分別為51.5%和32.4%。蒙特卡洛模擬分析表明,不論P(yáng)K/PD折點(diǎn)為AUC0-24h/MIC 6.96,還是fAUC0-24h/MIC 0.9,替加環(huán)素說明書劑量(50 mg/L q12h)及劑量加倍后的方案治療產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌感染時(shí)均不能達(dá)到CFR 90%目標(biāo)值;以AUC0-24h/MIC 25作為折點(diǎn),米諾環(huán)素說明書劑量(100 mg/L q 12h)及劑量加倍后的方案也均不能達(dá)到C F R 90%。( 2 )對(duì)于氨基糖苷類敏感菌株,50%以上菌株中替加環(huán)素或米諾環(huán)素聯(lián)合氨基糖苷類的FICI ≤ 0.5,其余菌株的FICI在0.5到1之間;對(duì)于氨基糖苷類高度耐藥菌株,替加環(huán)素或米諾環(huán)素與氨基糖苷類間并無(wú)明顯協(xié)同作用,FICI均大于1。時(shí)間-殺菌曲線進(jìn)一步驗(yàn)證了棋盤法的結(jié)果。替加環(huán)素對(duì)產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌的MPC值為4-32 mg/L,多黏菌素的MPC值為64- 128 mg/L,阿米卡星的MPC值為32-128 mg/L。替加環(huán)素聯(lián)合阿米卡星對(duì)4株細(xì)菌的MSW均值為12.0,顯著低于替加環(huán)素聯(lián)合多黏菌素E的200.1和多黏菌素E聯(lián)合阿米卡星的372.4,聯(lián)合用藥MSW與單藥MSW有顯著相關(guān)性。2MIC濃度的多黏菌素E聯(lián)合2 MIC替加環(huán)素或阿米卡星的耐藥突變頻率僅比單藥降低10-100倍:1 MIC替加環(huán)素聯(lián)合1 MIC阿米卡星的耐藥突變頻率比單藥降低了 1000-10000倍,2MIC濃度的兩種藥物聯(lián)合則可完全抑制耐藥突變菌生長(zhǎng)。(3)大鼠組織籠感染模型中,給藥組的細(xì)菌量變化與空白對(duì)照有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,聯(lián)合用藥組細(xì)菌量下降幅度最大,與4組單藥組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;替加環(huán)素或阿米卡星組與空白對(duì)照組間的細(xì)菌耐藥突變頻率在給藥前并無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;給藥7天后,替加環(huán)素單藥的兩組中細(xì)菌耐藥突變頻率較前明顯增加,1MIC濃度的耐藥突變頻率由原來(lái)的10-6上升為10-2左右;2MIC濃度時(shí)的耐藥突變頻率上升為10-3左右,且兩組中各有2只大鼠籠內(nèi)細(xì)菌的替加環(huán)素MIC變?yōu)樵瓉?lái)2倍。聯(lián)合用藥組中,在替加環(huán)素1MIC濃度時(shí),僅有一只大鼠的耐藥突變頻率為2.12×10-3,其余大鼠未有菌落生長(zhǎng),2MIC濃度時(shí)也未見菌落生長(zhǎng)。(4) Kp46號(hào)菌株及其米諾環(huán)素和替加環(huán)素耐藥突變菌株中均未檢出與四環(huán)素類耐藥相關(guān)的tet基因;Kp46及阿米卡星耐藥突變菌株中檢出aac(3)Ⅱ、aac(6')-I、ant(3")-I基因。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),這些基因并未表達(dá)或未表達(dá)增高,阿米卡星耐藥可能與翻譯延長(zhǎng)因子和多胺/腐胺轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)增高、NADH脫氫酶和K+-H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)降低相關(guān);慶大霉素耐藥產(chǎn)生可能與抗氧化壓力相關(guān)的Cpx系統(tǒng)表達(dá)增高、細(xì)胞色素表達(dá)降低相關(guān)。此外,慶大霉素耐藥菌株中還檢測(cè)到30S核糖體蛋白S22表達(dá)明顯降低,這也可能與慶大霉素耐藥相關(guān)。與臨床敏感菌株相比,氨基糖苷類耐藥突變菌株的細(xì)胞膜電位有顯著降低。不論是替加環(huán)素還是米諾環(huán)素,耐藥產(chǎn)生主要與外排泵表達(dá)增高相關(guān)。替加環(huán)素耐藥菌中ramA和acrB的平均相對(duì)表達(dá)水平分別增高了 70.4倍和6.8倍;米諾環(huán)素耐藥菌中ramA和acrB的平均相對(duì)表達(dá)水平分別增高了 11.6倍和3.6倍。結(jié)論:(1)產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌僅對(duì)多黏菌素、替加環(huán)素、米諾環(huán)素和阿米卡星有較高的敏感率,且替加環(huán)素、米諾環(huán)素的MIC值顯著高于非產(chǎn)KPC菌株;結(jié)合臨床PK/PD參數(shù)的蒙特卡洛模擬分析表明,不論是說明書推薦劑量,還是劑量加倍,替加環(huán)素和米諾環(huán)素單藥治療產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌感染的總體療效并不理想。(2)替加環(huán)素或米諾環(huán)素聯(lián)合氨基糖苷類對(duì)兩者均敏感菌株有很好的協(xié)同抗菌活性,多黏菌素、替加環(huán)素和阿米卡星單藥的MPC高、MSW寬,替加環(huán)素與阿米卡星聯(lián)合可以有效縮小甚至關(guān)閉MSW,較好抑制耐藥發(fā)生。(3)替加環(huán)素和阿米卡星單藥治療較易導(dǎo)致體內(nèi)耐藥突變菌株富集,聯(lián)合用藥療效優(yōu)于單藥,且耐藥突變頻率顯著降低,提示聯(lián)合用藥可抑制細(xì)菌耐藥發(fā)生。(4)替加環(huán)素聯(lián)合氨基糖苷類抑制耐藥發(fā)生的機(jī)制可能與不同耐藥突變菌株對(duì)細(xì)胞膜電位差需求不同相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 倪文濤;趙進(jìn);王睿;劉又寧;;聯(lián)合用藥治療產(chǎn)KPC腸桿菌科細(xì)菌感染研究進(jìn)展[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2017年04期

2 徐安;卓超;蘇丹虹;胡付品;朱德妹;汪復(fù);蔣曉飛;徐英春;張小江;孫自鏞;陳中舉;倪語(yǔ)星;孫景勇;胡志東;李金;張朝霞;季萍;王傳清;王愛敏;楊青;徐元宏;沈繼錄;單斌;杜艷;張泓;孔菁;魏蓮花;吳玲;謝軼;康梅;胡云建;艾效曼;俞云松;林潔;黃文祥;賈蓓;y囋譜，

本文編號(hào)：2271907