【摘要】：近年來,隨著人們對健康、環(huán)境的重視程度越來越高,與生命健康相密切相關(guān)各項的病原體檢測、產(chǎn)前診斷、遺傳病診斷、食品安全檢測變得越來越重要,核酸擴(kuò)增技術(shù)(Nucleic acid amplification technology,NAAT)可以從樣品中檢測出痕量目標(biāo)分子,具有靈敏特異等諸多優(yōu)勢,已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的一個基本和必要的技術(shù)手段,并在各個領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用,但是傳統(tǒng)的擴(kuò)增技術(shù)對實驗室、儀器及人員要求較高,快速、便攜、可應(yīng)用于床旁、現(xiàn)場檢測(point-of-care testing,POCT)的NAAT相對缺乏。近年來恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了NAAT技術(shù)在POCT中的應(yīng)用,它不需要高溫變性、退火等步驟,對精密儀器依賴程度大大降低,是實現(xiàn)POCT有效的技術(shù)手段。其中,重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)相較于其它恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)更具有優(yōu)勢,它對樣本要求低,可在25-45℃下15分鐘內(nèi)將痕量核酸模板擴(kuò)增到可檢測水平,與側(cè)流層析試紙條(lateral flow dipstick,LFD)結(jié)合應(yīng)用形成的LFD-RPA體系能實現(xiàn)肉眼直接判定結(jié)果,非常適合資源匱乏地區(qū)和野外應(yīng)用。目前,關(guān)于RPA技術(shù)的相關(guān)研究工作已多有報道,例如手足口病毒、結(jié)核分支桿菌、登革熱病毒、惡性瘧原蟲等病原體。以上這些工作都極大的推動了分子診斷技術(shù)在POCT領(lǐng)域中的應(yīng)用。但是,這些工作還存在的一個很大的缺陷就是,他們在從樣品準(zhǔn)備到結(jié)果判定的整個工作中,往往只針對其中的某個環(huán)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn),而沒有形成完整的診斷系統(tǒng),尤其沒有完全脫離對電的依賴,限制了其在野外及現(xiàn)場檢測中的廣泛應(yīng)用。此外,非封閉操作方式所形成的氣溶膠污染也是限制其應(yīng)用的瓶頸問題。本課題的目標(biāo)是,構(gòu)建一種集核酸提取、擴(kuò)增和結(jié)果判定功能的完整的檢測系統(tǒng),不僅能達(dá)到簡捷、靈敏、特異的檢測目的,而且全程不依賴電力,也無核酸氣溶膠污染的產(chǎn)生,以更好地為野外及現(xiàn)場檢測等POCT應(yīng)用服務(wù)。本研究中,本課題組通過文獻(xiàn)調(diào)研與預(yù)實驗,探索構(gòu)建最佳LFD-RPA反應(yīng)體系的方法。同時,設(shè)計了一個快速、簡易、無需加熱和離心操作的堿裂解-紙基快速核酸提取裝置(Alkaline lysis combined with paper-based filtration isolation of nucleic acid,ALP FINA)和一個能克服LFD-RPA氣溶膠污染問題的密閉可視化重組酶聚合酶核酸擴(kuò)增檢測裝置(Sealed and visual recombinase polymerase amplification test,SV RPA),將他們組合應(yīng)用后形成一個具備核酸提取、擴(kuò)增和結(jié)果判定功能的集成化的檢測體系。此檢測體系可以實現(xiàn)常溫下反應(yīng),30-40分鐘完成整個檢測。尤為重要的是,它可以在無電力的環(huán)境下應(yīng)用,非常適用于基層衛(wèi)生部門,尤其是在野外及現(xiàn)場檢測中具有極大優(yōu)勢。本研究將這個能夠?qū)崿F(xiàn)從樣本準(zhǔn)備到可視化檢測的完整的檢測體系,應(yīng)用于日本血吸蟲和腺病毒檢測,分別針對這兩種病原體建立快速、靈敏、特異、可視化的LFD-RPA檢測技術(shù),評價其靈敏度與特異性,驗證最佳反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間,并利用一定數(shù)量的臨床樣本,對檢測體系進(jìn)行效果評估。具體研究結(jié)果如下:一、簡易核酸提取方法的建立本研究中建立了堿裂解法結(jié)合紙基核酸純化的ALP FINA樣本處理體系,該體系包括過濾器和核酸提取膜,可用于不同類型樣本。它利用強(qiáng)堿使細(xì)胞膜及核膜迅速破裂,促進(jìn)核蛋白、核酸酶變性及DNA釋放,然后通過fusion 5膜進(jìn)行純化。通過與之匹配應(yīng)用的便攜式核酸提取器,可以使整個操作更加便捷、高效,只需向核酸提取器加樣口,順序加入標(biāo)本與NaOH混合液、無水乙醇及雙蒸水,中途無需過柱、離心、加熱等煩瑣步驟,也無需特殊的儀器設(shè)備及電力支持,整個過程只需10-15分鐘,且可用于不同類型樣本,非常適合現(xiàn)場核酸提取,可直接用于分子診斷和檢測實驗。二、LFD-RPA最佳檢測體系建立方法建立LFD-RP最佳體系的關(guān)鍵是引物及探針的設(shè)計。RPA引物設(shè)計原則為:引物長度30-35 bp;避免5’端長的G序列,否則會影響重組酶與引物結(jié)合;推薦3’端用G、C序列;自由能應(yīng)低于4 Kcal/mol;在30℃以下不會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。LFD-RPA探針設(shè)計原則:長46-52 bp;在距5’端最短30 bp,距3’端最遠(yuǎn)15 bp處堿基由四氫呋喃(THF)替代;5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)。三、基于LFD-RPA技術(shù)的日本血吸蟲檢測方法的建立與評價針對日本血吸蟲基因組重復(fù)序列SjR2設(shè)計并選取最佳引物,然后根據(jù)引物設(shè)計探針,建立LFD-RPA檢測體系。經(jīng)驗證,其靈敏度高,可達(dá)到5fg/μl,與qPCR結(jié)果一致;其特異性好,不會與其它人體寄生蟲發(fā)生交叉反應(yīng);且溫度要求低,反應(yīng)速度快,可以在25-45℃的溫度范圍內(nèi)15-20分鐘完成。當(dāng)分別應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)(ELSIA)、間接免疫技術(shù)(IHA)及LFD-RPA技術(shù),對14例經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)法(改良加藤法:Kato-Katz)檢測陽性患者及31例北京地區(qū)健康志愿者糞便樣本DNA進(jìn)行檢測,LFD-RPA檢測靈敏度為92.68%,特異性達(dá)100%,與金標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行Kappa一致性比對時結(jié)果為極好(κ=0.947,Z=6.36,P0.001),而ELSIA靈敏度85.71%,特異性93.55,kappa結(jié)果為較好(κ=0.793,Z=5.31,P0.001),IHA靈敏度78.57%,特異性83.87%,kappa結(jié)果為一般(κ=0.600,Z=4.05,P0.001)。以上結(jié)果證明,基于LFD-RPA技術(shù)的日本血吸蟲檢測體系,遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測技術(shù)。四、基于LFD-RPA技術(shù)的B、E型腺病毒檢測方法的建立與評價以B、E型腺病毒殼蛋白保守序列為檢測靶序列,建立基于LFD-RPA技術(shù)的檢測方法,此LFD-RPA檢測體系可同時檢出Adv-B及Adv-E且特異性極佳,不會與其它型別腺病毒及其它病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。它的檢測靈敏度高,對AdvB及AdvE的檢測下限均為10 copies/μl,雖然略低于qPCR(AdvB:5 copies/μl,AdvE:5 copies/μl),但已極為接近足以滿足臨床需要,且其簡便性及快速性遠(yuǎn)優(yōu)于qPCR。該檢測體系在20℃到45℃的溫度范圍內(nèi)均可以有效進(jìn)行,這樣的溫度范圍意味著該檢測體系可以擺脫對加熱設(shè)備的依賴。另外,通過對RPA的反應(yīng)時間分析,確定了它可以在10-15分鐘內(nèi)將靶核酸擴(kuò)增到可檢測水平,遠(yuǎn)快于PCR及免疫學(xué)等方法。當(dāng)對20例陽性和10例陰性臨床樣本進(jìn)行檢測時,其靈敏度和特異性均達(dá)100%。五、密閉LFD-RPA反應(yīng)裝置的研發(fā)本研究中研發(fā)了一種便攜、封閉的SV RPA核酸可視化檢測裝置,將整個LFD-RPA反應(yīng)體系整合于此裝置內(nèi),可使RPA擴(kuò)增、反應(yīng)介質(zhì)遞送和LFD檢測全過程在同一密閉空間完成,無需開蓋,可有效地避免核酸氣溶膠污染產(chǎn)生。六、核酸檢測完整體系的形成我們將快速簡易的核酸提取裝置ALP FINA與密閉可視化的SV RPA核酸檢測裝置組合形成了一個集核酸提取、擴(kuò)增和結(jié)果判定功能的檢測系統(tǒng)完整體系,可以實現(xiàn)常溫下反應(yīng),30-40分鐘完成整個核酸檢測過程。該系統(tǒng)所具備的特性使之非常適用于基層衛(wèi)生部門,尤其是在野外及現(xiàn)場檢測中具有極大優(yōu)勢。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R440

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2254653