【摘要】：目的:海洛因成癮是一種以易復(fù)發(fā)為特征的慢性腦病,研究表明海洛因成癮的發(fā)病學(xué)基礎(chǔ)是海洛因長期暴露后所致的大腦結(jié)構(gòu)與功能的適應(yīng)性改變:如與學(xué)習(xí)和記憶環(huán)路的受損以及腦內(nèi)神經(jīng)元可塑性和信號(hào)分子的表達(dá)改變。迄今為止,針對(duì)海洛因依賴者的治療手段主要仍是控制阿片戒斷綜合癥,但缺乏有效的抗海洛因復(fù)吸措施。如果能尋找到較特異的生物標(biāo)記物,可以指導(dǎo)和有效干預(yù)復(fù)吸行為。mi RNA是一類長約22個(gè)核苷酸大小的非編碼RNAs,可以調(diào)控靶基因的翻譯,與藥物成癮密切相關(guān),目前關(guān)于mi RNA與海洛因復(fù)吸行為之間的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究比較少。本課題選擇mi R-206為目標(biāo)深入探索它對(duì)海洛因復(fù)吸行為的影響,同時(shí)系統(tǒng)觀察它對(duì)相關(guān)靶基因表達(dá)影響旨在明確伏隔核mi R-206在大鼠海洛因復(fù)吸行為中的主要調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一通過基因芯片分析海洛因大鼠的伏隔核mi RNA表達(dá)譜,完成mi RNA的篩選和靶向分析SD雄性大鼠進(jìn)行連續(xù)14天的海洛因自身給藥訓(xùn)練(FR1,海洛因濃度0.05mg/injection/kg)。實(shí)驗(yàn)大鼠分3組:空白對(duì)照組(Control,n=3)、戒斷1天后線索誘導(dǎo)復(fù)吸組(CS1,n=3)、戒斷14天后線索誘導(dǎo)復(fù)吸組(CS14,n=3)。CS1組和CS14組分別于戒斷1天和戒斷14天后行線索誘導(dǎo)復(fù)吸行為測試,在行為測試結(jié)束后迅速斷頭取腦部伏隔核組織,3組樣本統(tǒng)一送基因公司進(jìn)行mi RNA表達(dá)譜分析,完成基因芯片的篩選工作,本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)遴選戒斷后表達(dá)增加的mi RNA。targetscan靶向分析方法:通過在線數(shù)據(jù)庫:mi Rbase,Targetscan,mi RWalk,microcosm Targets等數(shù)據(jù)庫,搜索mi R-206結(jié)合的靶基因,查閱文獻(xiàn)了解靶基因的相關(guān)作用。結(jié)果:通過基因芯片技術(shù),得到一系列mi RNA的表達(dá)譜,從中挑選出在CS1d與CS 14d表達(dá)有差異的mi RNA,參閱大量文獻(xiàn),選擇研究對(duì)象mi R-206。通過分析確定mi R-206目標(biāo)蛋白為BDNF/Me CP2/GABBR1。實(shí)驗(yàn)二驗(yàn)證海洛因成癮大鼠伏隔核mi R-206的表達(dá)方法:實(shí)驗(yàn)大鼠分3組:空白對(duì)照組(Control,n=4)、戒斷1天后線索誘導(dǎo)復(fù)吸組(CS1,n=4)、戒斷14天后線索誘導(dǎo)復(fù)吸組(CS14,n=4),Control組于戒斷第1天斷頭取伏隔核組織,CS1組大鼠于海洛因戒斷第1天測復(fù)吸行為后斷頭取腦部伏隔核,CS14組大鼠于戒斷14天后測復(fù)吸行為斷頭取腦部伏隔核提取RNA,通過q RT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證mi R-206的表達(dá)與基因芯片的分析結(jié)果是否一致。結(jié)果:單因素方差分析發(fā)現(xiàn),q RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果中mi R-206的表達(dá)在組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F(2,10)=5.44,P0.05)。相比于Control組,CS1組大鼠伏隔核的mi R-206表達(dá)明顯增加(P0.05);與CS1組相比,CS14組的大鼠伏隔核處mi R-206的表達(dá)明顯升高(P0.05)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與基因芯片分析的mi R-206表達(dá)譜一致。實(shí)驗(yàn)三觀察海洛因成癮大鼠的伏隔核不同程度表達(dá)mi R-206-3p對(duì)線索誘導(dǎo)的大鼠復(fù)吸行為的影響,并檢測目的蛋白的表達(dá)方法:將成功建立海洛因自身給藥的34只海洛因大鼠根據(jù)有效鼻觸隨機(jī)分為4組:14天戒斷的線索誘導(dǎo)復(fù)吸組(CS14,n=8),陰性對(duì)照組(LVGFP,n=8),mi R-206過表達(dá)組(LV-mi R-206-3p,n=9),mi R-206低表達(dá)組(LV-mi R-206-3p inhibition,n=9),借助大鼠腦立體定位技術(shù),分別于自身給藥訓(xùn)練結(jié)束后的2天內(nèi)將LV-GFP、LV-mi R-206-3p、LV-mi R-206-3p inhibition慢病毒注入對(duì)應(yīng)組別大鼠的伏隔核部位,術(shù)后連續(xù)給予3天青霉素(I.m,qd,400000 U/kg),戒斷14天后4組大鼠統(tǒng)一進(jìn)行2小時(shí)的線索誘導(dǎo)復(fù)吸行為測試,觀察mi R-206-3p不同程度的表達(dá)對(duì)大鼠海洛因復(fù)吸行為的影響。隨后斷頭取腦部伏隔核,通過q RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測mi R-206-3p的表達(dá)水平(每組4-5只),應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測BDNF/Me CP2/GABBR1的表達(dá)。結(jié)果:單因素方差分析發(fā)現(xiàn),組間有效鼻觸有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F(3,32)=3.42,P0.05),而無效鼻觸沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。兩兩比較顯示,LV-mi R-206-3p inhibition組的有效鼻觸相比LV-GFP組顯著增加(P0.05)。q RT-PCR實(shí)驗(yàn)中mi R-206的表達(dá)在組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F(3,13)=30.86,P0.05)。于此同時(shí),單因素方差分析發(fā)現(xiàn)各組間BDNF的表達(dá)水平(F(2.12)=29.75,P0.05)、Me CP2的表達(dá)水平(F(2.12)=3.90,P0.05)和GABBR1蛋白表達(dá)水平(F(3,14)=46.96,P0.05)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與LV-GFP組比較,LV-mi R-206-3pinhibition組BDNF和Me CP2表達(dá)水平均明顯增加(P0.05),而GABBR1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。實(shí)驗(yàn)四抑制伏隔核mi R-206-5p的表達(dá)對(duì)線索誘導(dǎo)大鼠復(fù)吸行為的影響方法:成功建立24只海洛因成癮大鼠,根據(jù)有效鼻觸隨機(jī)分為3組:14天戒斷的線索誘導(dǎo)復(fù)吸組(CS14,n=8),陰性對(duì)照組(LV-GFP,n=8),mi R-206-5p抑制組(LV-mi R-206-5p inhibition,n=8),借助大鼠腦立體定位技術(shù),于成癮訓(xùn)練結(jié)束后1天內(nèi)將LV-mi R-206-5p inhibition、LV-GFP病毒注入對(duì)應(yīng)組別大鼠的伏隔核部位,術(shù)后進(jìn)行連續(xù)3天的青霉素肌注(400000 U/kg),戒斷14天后3組大鼠統(tǒng)一進(jìn)行2小時(shí)的線索誘導(dǎo)復(fù)吸行為測試,觀察大鼠海洛因復(fù)吸行為的變化。結(jié)果:通過線索誘導(dǎo)的行為學(xué)測試發(fā)現(xiàn)伏隔核低表達(dá)mi R-206-5p對(duì)大鼠有效鼻觸數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F(2.22)=0.97,P0.05),表明對(duì)復(fù)吸行為并無明顯調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)五大鼠伏隔核部位消減Gabbr1對(duì)海洛因復(fù)吸行為的影響方法:成功建立26只大鼠海洛因成癮模型,根據(jù)有效鼻觸隨機(jī)分為3組:戒斷14天線索誘導(dǎo)復(fù)吸組(CS14,n=8),陰性病毒組(LV-GFP,n=9),Gabbr1表達(dá)抑制組(LV-si RNA-Gabbr1,n=9);LV-GFP組和LV-si RNA-Gabbr1組均于戒斷2天內(nèi)在伏隔核微注射相應(yīng)的慢病毒載體,3組大鼠統(tǒng)一在戒斷14天后進(jìn)行CS 2h的復(fù)吸測試,并灌流腦組織,觀察病毒轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果:通過CS 2h的行為學(xué)測試發(fā)現(xiàn)伏隔核低表達(dá)Gabbr1對(duì)大鼠有效鼻觸數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F(2.24)=1.20,P0.05),表明對(duì)大鼠海洛因復(fù)吸行為并無調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)六對(duì)海洛因成癮的大鼠伏隔核過表達(dá)Me CP2,觀察其復(fù)吸行為變化方法:成功建立24只大鼠海洛因成癮模型,據(jù)有效鼻觸隨機(jī)分成3組:戒斷14天誘導(dǎo)復(fù)吸組(CS14,n=8),陰性病毒組(LV-GFP,n=8),Me CP2過表達(dá)組(LV Me CP2,n=8),LV-GFP組和LV-Me CP2組均于戒斷第1天通過立體定位技術(shù),在伏隔核處注入等量的慢病毒。3組大鼠在戒斷14天后統(tǒng)一進(jìn)行CS 2h復(fù)吸測試,并斷頭取伏隔核組織,分別進(jìn)行后續(xù)的q RT-PCR及Western-blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:單因素方差分析發(fā)現(xiàn),成癮大鼠各組間有效鼻觸有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F(2,22)=3.57,P0.05),無效鼻觸沒明顯差異(P0.05),各組間BDNF的表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F(2.12)=25.65,P0.05),各組間Me CP2的表達(dá)水平亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F(2.12)=11.01,P0.05)。與LV-GFP組比較,LV-Me CP2組的BDNF和Me CP2表達(dá)水平均明顯增加(P0.05)。實(shí)驗(yàn)七雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測mi R-206與Me CP2基因的調(diào)控關(guān)系方法:實(shí)驗(yàn)分為6組:control+mi RNA-206、control+mi RNA-206-NC、Me CP2WT+mi RNA-206、Me CP2WT+mi RNA-206-NC、Me CP2MU+mi RNA-206以及Me CP2MU+mi RNA-206-NC;將0.1μg Me CP2基因的質(zhì)粒(control,Me CP2WT,Me CP2mutant)、0.4μg mi RNA-206質(zhì)粒(mi RNA-206和mi RNA-206NC)和0.02μg Renilla質(zhì)粒通過ROCHE試劑盒轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后,Promega檢測各組熒光值。觀察mi R-206對(duì)Me CP2WT組熒光蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:Me CP2WT+mi RNA-206組和Me CP2WT+mi RNA-206-NC組的熒光表達(dá)量比較有所減少(P=0.025)。結(jié)果提示mi R-206可直接部分抑制Me CP2基因的表達(dá)。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)海洛因成癮戒斷14天后伏隔核mi R-206的表達(dá)升高,而抑制mi R-206后大鼠海洛因復(fù)吸行為增強(qiáng),結(jié)果提示戒斷后伏隔核mi R-206的表達(dá)對(duì)海洛因復(fù)吸行為具有保護(hù)性作用。通過對(duì)預(yù)測的mi R-206調(diào)控的目的基因進(jìn)行驗(yàn)證分析,表明mi R-206對(duì)BDNF和Me CP2的表達(dá)有調(diào)控作用;抑制mi R-206后Me CP2表達(dá)增高,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mi R-206輕度調(diào)控Me CP2的表達(dá),因此,mi R-206可能靶向調(diào)節(jié)BDNF和Me CP2的表達(dá)起到對(duì)復(fù)吸行為的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R749.64

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 梁艷;徐波;張雪純;宗蕾;陳躍來;;電針與耳針對(duì)甲基苯丙胺成癮者戒斷癥狀療效差異的比較研究[J];中國針灸;2014年03期

2 郭烈美;周洪語;王冉;鐘志宏;徐紀(jì)文;江基堯;周文華;張富強(qiáng);唐甩恩;劉惠芬;;腦深部電刺激伏核對(duì)自身給藥大鼠海洛因覓藥行為的影響[J];立體定向和功能性神經(jīng)外科雜志;2010年02期

，

本文編號(hào)：2237206