【摘要】：背景:移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是造血干細胞移植后是影響患者總生存率和生存質(zhì)量的主要因素。激素是治療急性和慢性GVHD的一線用藥,然而50%患者因?qū)に刂委煙o反應(yīng)而需要二線藥物治療,但由于二線藥物缺乏統(tǒng)一標準,不僅導(dǎo)致治療效果不確定而且藥物相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率較高。此外,部分慢性GVHD患者存在激素依賴,而長期應(yīng)用激素引起的感染、高血糖癥、高血壓、骨質(zhì)疏松癥和消化系統(tǒng)疾病等,影響著患者的生存質(zhì)量。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BMSC)具有低免疫原性、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)特性以及遷移到受損傷組織促進組織修復(fù)等特征備受關(guān)注,研究顯示輸注BMSC對激素抵抗型GVHD是有效的,且未發(fā)現(xiàn)輸注相關(guān)不良反應(yīng)。骨髓造血微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持依賴于骨髓細胞間頻繁的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),而以間隙連接蛋白43(connexin 43,CX43)為基礎(chǔ)的間隙連接細胞通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)是骨髓基質(zhì)細胞間普遍存在的直接通訊方式。骨髓基質(zhì)細胞CX43表達的缺陷會影響造血干細胞的植入及化療后造血的恢復(fù)。而白血病造血調(diào)控異常極有可能與白血病骨髓基質(zhì)細胞CX43表達的降低或缺失、GJIC功能下降有關(guān)。鑒于此,我們設(shè)想通過構(gòu)建穩(wěn)定表達CX43基因的BMSC體系,力圖為深入探索在GVHD中,CX43基因修飾的BMSC是否會通過增加BMSC間及BMSC與骨髓其他細胞間的信息通訊更好的發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用提供理論及實驗的證據(jù)。目的:建立小鼠BMSC體外培養(yǎng)體系,構(gòu)建CX43基因過表達的重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染小鼠BMSC。以期為探討CX43基因修飾的小鼠BMSC在GVHD中的作用奠定基礎(chǔ)。方法:1.采用全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法獲取小鼠BMSC,流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志,行成骨、成脂、成內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化并分別用茜素紅染色、油紅染色和免疫熒光及成小管特性鑒定。2.采用限制性內(nèi)切酶EcoRI/XbaI雙酶切含目的基因的質(zhì)粒和慢病毒載體,再用DNA連接酶將目的基因與線性化的慢病毒載體進行連接,獲得重組慢病毒載體,先進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,再對其測序分析,將測序正確的載體和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293FT細胞進行病毒包裝,收集、濃縮病毒液后用孔稀釋法測定其滴度,并采用實時定量PCR對CX43基因表達進行鑒定。然后用重組慢病毒pHBLV~(TM)-CX43-GFP、pHBLV~(TM) GFP感染BMSC,最后采用免疫細胞熒光技術(shù)、免疫細胞化學法和Western blot方法檢測感染前后CX43蛋白表達的變化。結(jié)果:1.經(jīng)細胞流式鑒定示BMSC表達CD73、CD44、CD29、CD90,不表達CD34、CD105;成骨誘導(dǎo)分化結(jié)束后茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié);成脂誘導(dǎo)分化后倒置顯微鏡下可見明顯脂滴經(jīng)油紅染色呈陽性;成內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)分化后經(jīng)免疫熒光檢測示內(nèi)皮細胞標識CD31、CD34表達明顯增加,將細胞接種于Matrigel基底膠上有小管形成。2.瓊脂糖凝膠電泳鑒定和測序分析均證明CX43慢病毒載體構(gòu)建成功,測定濃縮后病毒滴度為1×108/mL,實時定量PCR鑒定CX43基因在293FT細胞的表達明顯增加;采用免疫細胞化學法、免疫細胞熒光技術(shù)和Western blot方法測定BMSC的CX43蛋白的表達,結(jié)果均顯示pHBLV~(TM)-CX43-GFP轉(zhuǎn)染組的CX43蛋白表達高于對照組(P0.05)。結(jié)論:1.成功建立了小鼠BMSC體外分離培養(yǎng)體系。2.成功構(gòu)建了CX43基因過表達慢病毒載體,慢病毒介導(dǎo)CX43基因修飾小鼠BMSC體系的構(gòu)建成功
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【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R457.7

【參考文獻】

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本文編號：2192488