本文選題：數(shù)字PCR + 甲型流感病毒��； 參考：《中國疾病預(yù)防控制中心》2017年碩士論文

【摘要】：流行性感冒簡稱流感,是一種重要的呼吸道傳染病,可引起嚴(yán)重的疾病負擔(dān),造成較高的發(fā)病率和死亡率。在臨床上,有效地抗病毒治療可以治療流感。定量檢測流感病毒載量的變化,有助于評價抗病毒治療的效果,對監(jiān)測疾病的治療和轉(zhuǎn)歸有很好的指示作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,核酸定量檢測的方法也在不斷的更新。目前,核酸定量檢測方法主要有依賴核酸序列的擴增技術(shù)、分支鏈DNA信號放大技術(shù)、以及普遍應(yīng)用的實時熒光定量PCR技術(shù)等。近幾年,新的核酸定量方法--數(shù)字PCR技術(shù),也被廣泛應(yīng)用,多用于對樣本進行的絕對定量檢測,由此給人們提供了新的核酸定量方法。數(shù)字PCR技術(shù)(DigitalPCR,dPCR),是將標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系,分配到成千上萬個小的PCR反應(yīng)體系中,盡可能使每個PCR反應(yīng)孔中含有“1”個或“0”個模板,然后在PCR儀上進行PCR擴增;根據(jù)PCR結(jié)果中熒光信號的有和無,進行樣本拷貝數(shù)的統(tǒng)計,最后通過泊松的統(tǒng)計學(xué)方法進行處理,從而得到樣本中的拷貝數(shù)。數(shù)字PCR技術(shù),可以進行絕對定量,而不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。目前,已有研究利用數(shù)字PCR方法對腺病毒、乙型肝炎病毒、HIV病毒等進行絕對定量。針對甲型流感病毒的數(shù)字PCR絕對定量方法,還沒有系統(tǒng)建立和應(yīng)用,因此本研究擬建立基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的甲型流感病毒絕對定量方法。本研究首先利用微滴式數(shù)字PCR定量甲型流感病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品,對退火溫度進行了優(yōu)化,確定了其最佳退火溫度為64.4 ℃;利用倍比稀釋的核酸標(biāo)準(zhǔn)品,確定了微滴式數(shù)字PCR的檢測范圍至少在四個數(shù)量級,方法檢測的定量限為23 coPies/μl;微滴式數(shù)字PCR的檢測定量結(jié)果與核酸標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9988,表明該方法檢測結(jié)果具有較高的可信度。用建立好的微滴式數(shù)字PCR方法對待檢測甲型流感病毒臨床樣進行了拷貝數(shù)定量。因此本研究建立了基于微滴式數(shù)字PCR的甲型流感病毒絕對定量方法,可有效地對臨床樣本中甲型流感病毒載量進行絕對定量,為臨床研究中病毒載量的檢測提供了一種新的定量技術(shù)。通過建立好的微滴式數(shù)字PCR檢測方法,我們比較了微滴式數(shù)字PCR和實時熒光定量PCR兩種方法定量的準(zhǔn)確性、靈敏度及檢測結(jié)果的一致性。利用兩種方法同時對甲型流感病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品進行定量,實時熒光定量PCR的方法通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算定量樣本的拷貝數(shù),從而和微滴式數(shù)字PCR定量的拷貝數(shù)直接進行比較。從定量結(jié)果可以看出,微滴式數(shù)字PCR對核酸標(biāo)準(zhǔn)品定量拷貝數(shù)更接近標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,定量的濃度高于實時熒光定量PCR的定量結(jié)果,準(zhǔn)確性更好;對于低濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品,當(dāng)實時熒光定量PCR的Ct值為35時(濃度較小的核酸標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值均為35)微滴式數(shù)字PCR也可以進行定量,其靈敏度略高于實時熒光定量PCR,但兩者定量結(jié)果沒有差異。臨床樣本的檢測結(jié)果,經(jīng)過Bland-Altman分析,兩種方法具有很好的定量一致性,兩種方法的95%一致性界限 95%(Limit of Agreement(LoA))為-0.2814 至 0.1686;其次對于濃度較高的樣本,微滴式數(shù)字PCR不能進行定量,超過了其檢測范圍,需要將樣本稀釋重新進行定量。綜上所述,本研究系統(tǒng)的建立了基于微滴式數(shù)字PCR檢測甲型流感病毒的絕對定量方法,確定了微滴式數(shù)字PCR的檢測范圍以及定量限。此外,比較了微滴式數(shù)字PCR和實時熒光定量PCR的檢測一致性,表明微滴式數(shù)字PCR可以有效的對臨床樣本進行定量檢測。因此,通過建立該方法可以有效地對甲型流感病毒進行定量,為臨床提供了新的定量檢測方法,可以更加準(zhǔn)確的監(jiān)測病毒載量的變化,指導(dǎo)臨床的藥物治療,監(jiān)測治療的效果,對于疾病的轉(zhuǎn)歸具有重要的意義。
[Abstract]:A method for absolute quantification of influenza A virus based on microtitre digital PCR has been established . A quantitative analysis of influenza A virus based on micro - drop type digital PCR has been established . The results show that the detection range and the quantification limit of microtitre digital PCR are higher than that of real - time fluorescence quantitative PCR .
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R440;R511.7

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本文編號：2033211