發(fā)布時(shí)間：2018-05-22 18:10

  本文選題：深度測(cè)序 + 臨床診斷　； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing)又稱深度測(cè)序,下一代測(cè)序技術(shù)[1](Next-generation sequencing technology,NGS),在過(guò)去十年中快速發(fā)展。測(cè)序通量變大、測(cè)序速度變快、測(cè)序質(zhì)量變高[2],測(cè)序成本已由1億美金降至1000美金甚至正在往100美金靠近。這些重大變革改變了傳統(tǒng)基因組的分析方法并為NGS臨床微生物檢測(cè)開(kāi)拓了領(lǐng)域[3]。NGS對(duì)微生物學(xué)的影響是革命性的,不再依賴分離培養(yǎng)而是使用宏基因組學(xué)和微生物組學(xué)研究宿主和微生物之間的相互作用[4]。近年來(lái)有越來(lái)越多的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)報(bào)道將這種新技術(shù)用于傳染病診斷和病原體分析方面,一些病例報(bào)告和臨床研究[5]也顯示了NGS作為單一診斷未知病原體引起的感染性疾病的工具,具有強(qiáng)大的潛力和適應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)人員僅需采血1~2 mL,在2個(gè)工作日內(nèi)即可完成臨床標(biāo)本的病原體鑒定、分型、耐藥基因和毒力因子檢測(cè)[6],可以對(duì)重大公共衛(wèi)生事件做出及時(shí)應(yīng)對(duì)和控制。盡管越來(lái)越多的科研人員應(yīng)用基于測(cè)序的實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究疾病的病理生理學(xué)[7]、流行病學(xué)和臨床診斷學(xué),但由于一些技術(shù)上的挑戰(zhàn),例如臨床樣本的前處理、測(cè)序策略的選擇、數(shù)據(jù)的分析,而且缺乏適用的市場(chǎng)監(jiān)管指南,在醫(yī)療實(shí)踐中推廣NGS還是一個(gè)緩慢的過(guò)程。2016年5月13日,美國(guó)食品藥品監(jiān)督總局(Food and Drug Administration,FDA)公布了NGS感染病診斷指南草案,指出NGS直接檢測(cè)可以用于微生物鑒定,抗菌藥物耐藥性和毒力標(biāo)志物的檢測(cè),推廣到臨床需要監(jiān)督管理,需要加大關(guān)注臨床NGS產(chǎn)品的特異性、敏感性、最低檢測(cè)線、可重復(fù)性以及質(zhì)量控制。這也是一個(gè)將NGS從實(shí)驗(yàn)室推廣到臨床的重大轉(zhuǎn)折點(diǎn),一旦市場(chǎng)監(jiān)督規(guī)范化,測(cè)序成本降低,NGS會(huì)給臨床診斷疾病帶來(lái)更多的幫助。本研究檢測(cè)了三例未知病原體感染標(biāo)本,我們使用Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)[8]進(jìn)行測(cè)序,對(duì)不同類型的標(biāo)本采用不同的前處理方法,如使用痰消化液處理痰液標(biāo)本,去除宿主細(xì)胞,提取核酸、富集病原體,然后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,測(cè)序后使用自主研發(fā)的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)病原體歸類分析軟件V1.0將測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床可行性報(bào)告。通過(guò)對(duì)樣本的測(cè)序分別發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌Bacillus cereus、病毒Hepatitis C virus和真菌曲霉菌,經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)鑒定和實(shí)時(shí)熒光定量PCR[9]等方法進(jìn)行驗(yàn)證,然后為臨床治療提供及時(shí)有效的信息。MDA是一種使用Phi29 DNA聚合酶的擴(kuò)增方法,Phi29 DNA聚合酶可以對(duì)環(huán)狀DNA和線性DNA進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增,即多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification,MDA)。MDA是近年來(lái)發(fā)展較快的一種全基因組擴(kuò)增方法,可以用來(lái)非特異性擴(kuò)增核酸達(dá)到文庫(kù)構(gòu)建的要求。此外,本研究從33份血液標(biāo)本中提取病毒核酸,使用多重置換擴(kuò)增技術(shù)富集指環(huán)病毒,然后使用Ion Torrent PGM平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。共得到226個(gè)新的指環(huán)病毒序列,包括130條全序和96個(gè)ORF1(Open Reading Frame,ORF)。受檢血液標(biāo)本均檢出Torque teno virus(TTV)、Torque teno midi virus(TTMDV)和Torque teno mini virus(TTMV)等指環(huán)病毒,顯示我國(guó)人群普遍攜帶指環(huán)病毒。13.27%的序列在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中同源比對(duì)未成功,說(shuō)明病毒序列多樣性高,臨床意義有待研究。TTV分為5個(gè)基因型:基因1-5型,進(jìn)化分析顯示基因2型是基因3型的子分枝,這一結(jié)果提示基因3型應(yīng)劃歸基因2型。綜上所述,本研究采用了不同的樣本前處理方法處理不同來(lái)源的臨床標(biāo)本,使用Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)自主研發(fā)的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)病原體歸類分析軟件V1.0對(duì)病原體進(jìn)行快速篩查分析,篩查標(biāo)本感染的病原體種類、型別、毒力基因和耐藥基因,還可以研究進(jìn)化關(guān)系以及與宿主的相互作用,為臨床治療提供信息與指導(dǎo)。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,NGS會(huì)給臨床帶來(lái)更多的幫助,隨著測(cè)序成本的降低,NGS也會(huì)更多應(yīng)用于臨床。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Zhiqiang Mi;Xin Yuan;Guangqian Pei;Wei Wang;Xiaoping An;Zhiyi Zhang;Yong Huang;Fan Peng;Shasha Li;Changqing Bai;Yigang Tong;;High-throughput sequencing exclusively identified a novel Torque teno virus genotype in serum of a patient with fatal fever[J];Virologica Sinica;2014年02期

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本文編號(hào)：1923111