本文選題：Nedd4　切入點(diǎn)：非經(jīng)典炎癥小體　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：膿毒癥是臨床常見的全身性炎癥反應(yīng)綜合癥,感染、創(chuàng)傷、燒傷、休克等均是其誘因,且死亡率高,是臨床常見的并發(fā)癥之一。研究表明,膿毒癥早期機(jī)體會產(chǎn)生過度、過多的促炎因子,雖然促炎反應(yīng)有利于清除病原菌,但過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致細(xì)胞過度焦亡,增加機(jī)體的免疫損傷。炎癥小體在炎癥反應(yīng)中具有重要作用,它是由模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)檢測病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)后,直接或者通過ASC接頭蛋白同Pro-Caspase-1蛋白形成的復(fù)合物,隨即使Caspase-1活化,剪切Pro-IL-1β和Pro-IL-18,并釋放IL-1β和IL-18,這也稱為經(jīng)典炎癥小體。2011年Kayagaki研究發(fā)現(xiàn)Caspase-11是小鼠革蘭氏陰性菌膿毒癥死亡的主要原因,并由此提出了非經(jīng)典炎癥小體。非經(jīng)典炎癥小體以Caspase-11為核心,Caspase-11作為胞內(nèi)模式識別受體識別胞內(nèi)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),與LPS結(jié)合后發(fā)生寡聚化而活化,繼而使細(xì)胞發(fā)生炎性焦亡,以抵御革蘭氏陰性菌感染,但是非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控機(jī)制一旦失調(diào),則可能會引起非經(jīng)典炎癥小體的過度激活,最終導(dǎo)致膿毒癥死亡,所以亟需對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn),泛素化在經(jīng)典炎癥小體中具有重要的調(diào)控作用,ASC的線性泛素化是NLRP3經(jīng)典炎癥小體激活所必須的,泛素化編輯酶A20亦可通過阻斷NF-κB通路下調(diào)NLRP3、Pro-IL-1β和Pro-IL18的表達(dá),從而負(fù)調(diào)控NLRP3經(jīng)典炎癥小體。我們實(shí)驗(yàn)室成員在國外博士后研究期間發(fā)現(xiàn)E3泛素化連接酶Cbl-b通過泛素化修飾NLRP3蛋白負(fù)調(diào)控炎癥小體的激活,但是到目前為止關(guān)于泛素化對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用仍未見報(bào)道。Nedd4是一種重要的HECT型E3泛素連接酶,在多種細(xì)胞中表達(dá),且具有多種底物分子,參與著眾多生理過程,研究發(fā)現(xiàn),Nedd4可通過泛素化Cbl-b促進(jìn)Th細(xì)胞活化,在B細(xì)胞中Nedd4可通過對TRAF3 K63形式的泛素化調(diào)節(jié)CD40介導(dǎo)的AKT通路,參與著免疫球蛋白類型的轉(zhuǎn)換。說明Nedd4在獲得性免疫的調(diào)控中具有重要作用,但是在天然免疫中的作用,尤其是對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用及機(jī)制需進(jìn)一步探討,因此本研究將探討Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用及機(jī)制,為以后干預(yù)由革蘭氏陰性菌所引起的膿毒癥提供理論依據(jù)。第一部分 Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體調(diào)控作用的研究本部分研究旨在探討Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用。首先利用Nedd4+/-小鼠在小鼠水平探討Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用。利用低劑量LPS(400ng/kg)腹腔注射Nedd4+/-和野生型小鼠進(jìn)行引發(fā)(Priming)7小時,然后使用高劑量LPS(10mg/kg)刺激小鼠(activation),建立非經(jīng)典炎癥小體激活模型,觀察小鼠24小時內(nèi)存活率,檢測血清中IL-1β含量,HE染色觀察臟器炎性損傷。隨后在細(xì)胞水平探討Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用。利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立Nedd4敲除的BMDM細(xì)胞系。使用LPS(500ng/ml)引發(fā)Nedd4敲除及其對照細(xì)胞4小時,然后按照1×106/ug LPS進(jìn)行電轉(zhuǎn),建立非經(jīng)典炎癥小體激活模型,2.5小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,檢測LDH釋放。此外使用LPS(500ng/ml)引發(fā)Nedd4敲除及其對照細(xì)胞7小時,將LPS濃度調(diào)整為2ug/ml同時使用8(16)ug/ml CTB介導(dǎo)LPS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,16小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測LDH釋放,對電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,相對于野生型小鼠,Nedd4+/-小鼠生存率顯著降低,血清中IL-1β含量顯著升高,心肝具有較嚴(yán)重的炎性損傷;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相對于對照組,Nedd4敲除后細(xì)胞死亡率顯著升高,且呈現(xiàn)CTB劑量依賴效應(yīng)。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體具有抑制作用,這為下一步研究調(diào)控的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。第二部分 Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體調(diào)控作用的機(jī)制研究本部分研究在第一部分研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,以非經(jīng)典炎癥小體的核心分子Caspase-11為切入點(diǎn),在m RNA水平和蛋白水平初步探討Nedd4調(diào)控非經(jīng)典炎癥小體的分子機(jī)制,一、Nedd4對Caspase-11蛋白m RNA水平調(diào)控的研究本章節(jié)探究Nedd4對Caspase-11蛋白m RNA水平調(diào)控作用,通過序列分析,Caspase-11的上游分子p38αVariant2具有Nedd4所特異性識別的結(jié)構(gòu)域,推測p38α可能為Nedd4的底物分子,Nedd4通過調(diào)控p38MAPK通路調(diào)控Caspase-11 m RNA水平。首先利用Real-time PCR的方法探討Nedd4對Caspase-11 m RNA的調(diào)控作用,然后利用LPS刺激Nedd4穩(wěn)定敲低(敲除)及其對照細(xì)胞,293T細(xì)胞共轉(zhuǎn),MG132和氯喹阻斷等實(shí)驗(yàn)手段,通過ELISA、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、Western blot技術(shù)、免疫共沉淀、Ni-NTA純化、質(zhì)譜分析等方法進(jìn)一步進(jìn)行研究。與對照組相比,Nedd4穩(wěn)定敲低(敲除)組Caspase-11的m RNA水平顯著升高;TNF-α的分泌顯著增加;p-p38(p38)的蛋白水平顯著升高;雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nedd4抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性;p-p38(p38)蛋白經(jīng)泛素化由蛋白酶體和溶酶體途徑進(jìn)行降解;Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,磷酸化影響Nedd4與p38αV1的相互作用,但對Nedd4與p38αV2的相互作用沒有影響;泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Nedd4參與著p38αK48和K63兩種形式的泛素化,磷酸化顯著增強(qiáng)Nedd4對p38αV1/2的K48形式的泛素化;質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),p38αV1在K45、K53(K54)和K152位點(diǎn)具有泛素化修飾,p38αV2的K53(K54)、K287和K295位點(diǎn)具有泛素化修飾,K53(K54)位點(diǎn)是共有的泛素化位點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:Nedd4可通過對p38α直接泛素化使其進(jìn)行降解,起到對p38MAPK通路的負(fù)調(diào)控作用,從而實(shí)現(xiàn)對Caspase-11 m RNA的負(fù)調(diào)控。二、Nedd4對Caspase-11蛋白水平調(diào)控的研究本章主要研究Nedd4在蛋白水平對Caspase-11的調(diào)控作用,并初步探討其分子機(jī)制。如第一章所述方法,使用LPS刺激、293T細(xì)胞共轉(zhuǎn),mg132和氯喹阻斷等實(shí)驗(yàn)手段,通過Real-time PCR、Western blot技術(shù)、免疫共沉淀、Ni-NTA純化等檢測方法進(jìn)行探討。與對照組相比,Nedd4穩(wěn)定敲低(敲除)組的Caspase-11蛋白水平顯著升高;Caspase-11蛋白經(jīng)泛素化由蛋白酶體途徑進(jìn)行降解;Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Nedd4可與Caspase-11蛋白發(fā)生直接的相互作用;泛素化實(shí)驗(yàn)表明,Nedd4對Caspase-11蛋白具有直接的泛素化作用。該結(jié)果提示Nedd4可通過與Caspase-11蛋白的直接相互作用對其進(jìn)行泛素化,使其進(jìn)入蛋白酶體進(jìn)行降解,說明Nedd4可直接在蛋白水平調(diào)控Caspase-11。綜上所述:本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)探討Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用,并對其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明,Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體具有負(fù)調(diào)控作用。Nedd4可通過負(fù)調(diào)控p38αMAPK通路實(shí)現(xiàn)對非經(jīng)典炎癥小體的核心分子Caspase-11 m RNA水平的調(diào)控作用,同時Nedd4可直接泛素化Caspase-11使其進(jìn)行降解,從而實(shí)現(xiàn)對Caspase-11蛋白水平的調(diào)控。Nedd4在m RNA水平和蛋白水平對Caspase-11蛋白進(jìn)行調(diào)控,從而實(shí)現(xiàn)對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控,這為后期臨床干預(yù)革蘭氏陰性菌膿毒癥奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:In 2011 , it was found that the expression of Caspase - 11 was the main cause of death of Gram - negative bacteria in mice . The effects of Nedd4 on the control of non - classical inflammatory small bodies were investigated . The results showed that Nedd4 had an important role in the regulation of non - classical inflammatory small bodies . The effects of Nedd4 on the expression of Caspase - 11 mRNA were investigated by means of real - time PCR . The results showed that Nedd4 was involved in the regulation of p38 偽V1 / 2 . The results showed that Nedd4 was involved in the regulation of p38MAPK . The results showed that Nedd4 was involved in the regulation of p38MAPK pathway . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly . The results suggest that Nedd4 can regulate the expression of Caspase - 11 directly .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R459.7
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本文編號：1729098