本文選題：乳腺癌　切入點(diǎn)：自噬　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乳腺癌(Breast Cancer,BC)是全世界婦女中最常見(jiàn)的癌癥,據(jù)估計(jì),每年大約有130萬(wàn)女性罹患BC。BC在女性癌癥死亡率中排在第二位,在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家造成每年約35萬(wàn)婦女的死亡。許多因素參與了BC的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展,包括遺傳、生物和環(huán)境因素,以及生活方式。放射治療(RT)是乳腺癌治療的方法之一,其治療效果取決電離輻射作用的腫瘤靶區(qū)以及優(yōu)化的照射方案(單次劑量、累積劑量、分割方案等),最終達(dá)到優(yōu)先殺死腫瘤細(xì)胞少傷害正常細(xì)胞的作用。電離輻射可引起腫瘤細(xì)胞不同類型的死亡,其中包括:凋亡、自噬、壞死、有絲分裂災(zāi)難(MC)等。電離輻射誘導(dǎo)的自噬在腫瘤細(xì)胞中作用機(jī)制較為復(fù)雜,尤其是在自噬基因Beclin-1單等位缺失的乳腺癌中。TP53INP(腫瘤蛋白53誘導(dǎo)核蛋白)家族包括TP53INP1和TP53INP2。TP53INP1在1990年代末由三個(gè)不同的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn),2002年,人類基因組基因命名委員會(huì)最終確認(rèn)基因?yàn)門P53INP1,在人類基因中,TP53INP1基因定位于染色體上8q22。已有的研究發(fā)現(xiàn)TP53INP1是一個(gè)抑癌基因,在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)低。TP53INP1是p53的一個(gè)重要靶基因,TP53INP1的表達(dá)可由p53、p73、E2F1等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。已有研究證實(shí)TP53INP1可與MAPLC3、GABARAP和GABARAP樣蛋白2相互作用,TP53INP1的氨基末端部分含有LC3相互作用區(qū)域(LIR)可與MAPLC3相互作用,TP53INP1促進(jìn)自噬性細(xì)胞死亡。我課題組在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中證實(shí)電離輻射引起TP53INP1表達(dá)增加,因而TP53INP1在電離輻射引起的乳腺癌細(xì)胞自噬中所起的作用值得深入探討。目的:本論文擬闡述TP53INP1在電離輻射誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬中的作用及機(jī)制,發(fā)現(xiàn)電離輻射誘導(dǎo)自噬中新的調(diào)控通路,為放射治療腫瘤提供新的靶點(diǎn),提高腫瘤放療的效果。方法:1.選取人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,構(gòu)建穩(wěn)定的TP53INP1基因沉默細(xì)胞模型(TP53INP1Ri)及對(duì)照的空載體(p SUPER)細(xì)胞。2.用深部X射線照射機(jī)照射細(xì)胞,照射劑量分別為0、2、4、6、8Gy,照射的劑量率為1.02Gy/min、靶皮距70cm。3.采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)照射后的細(xì)胞死亡率,并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。4.基因工程構(gòu)建并轉(zhuǎn)染RFP-LC3進(jìn)入細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的自噬。5.應(yīng)用集落形成法檢測(cè)電離輻射后的細(xì)胞存活情況。6.采用熒光染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)自噬與凋亡。7.蛋白表達(dá)采用Western blot檢測(cè)。8.用免疫熒光抗體染色檢測(cè)不同蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位。9.免疫共沉淀法檢測(cè)不同蛋白質(zhì)之間的相互作用。10.染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測(cè)DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。結(jié)果:1電離輻射誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬分別采用MDC染色形態(tài)學(xué)觀察法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在不同劑量照射后,即0、2、4、6、8Gy照射后自噬的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)照射組細(xì)胞中自噬空泡明顯增多并且自噬的發(fā)生率呈現(xiàn)劑量依賴性增加。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3,MAPLC3)是哺乳動(dòng)物中酵母自噬相關(guān)基因atg8的同源體,是自噬起始因子。細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自噬時(shí)LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ,LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上。因而將MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RFP-LC3質(zhì)粒(RFP-LC3),選取4Gy照射轉(zhuǎn)染RFP-LC3的細(xì)胞后24小時(shí),通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中RFP-LC3的表達(dá),鏡下圖像可見(jiàn)MAPLC3的點(diǎn)狀聚集明顯增多。4Gy照射后24小時(shí)通過(guò)Western blot檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白MAPLC3和Beclin1的表達(dá),結(jié)果表明細(xì)胞照射后MAPLC3和Beclin1表達(dá)均增加,提示電離輻射誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬。2電離輻射誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡用臺(tái)盼藍(lán)染色流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)細(xì)胞自噬發(fā)生率最高的8Gy照射后1、2、4、12、24、48、72小時(shí)MCF-7細(xì)胞的死亡率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞死亡率呈現(xiàn)時(shí)間依賴性增加。3-甲基腺苷(3MA)是自噬抑制劑,通過(guò)抑制Beclin1-Ptd Ins3KC3復(fù)合物的形成抑制細(xì)胞質(zhì)中LC3-I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ,從而抑制自噬體的形成。將MCF-7細(xì)胞中加入3MA,再給予0、2、4、6、8Gy照射,采用MDC染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)照射后有3MA組較無(wú)3MA組細(xì)胞存活率明顯增加。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)3MA作用與非作用的MCF-7細(xì)胞4Gy照射后細(xì)胞自噬與凋亡的變化,結(jié)果表明3MA作用后抑制電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬,而對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用不顯著。沉默MCF-7細(xì)胞中自噬相關(guān)基因Beclin1和ATG5,4Gy照射后臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的死亡率,發(fā)現(xiàn)照射引起的細(xì)胞死亡發(fā)生逆轉(zhuǎn),提示電離輻射誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡。3 TP53INP1參與電離輻射引起的自噬首先通過(guò)高通量基因芯片分析,發(fā)現(xiàn)電離輻射引起乳腺癌MCF-7細(xì)胞中TP53INP1上調(diào),通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)TP53INP1表達(dá)增加。為研究TP53INP1是否參與電離輻射引起的自噬,我們構(gòu)建了TP53INP1Ri以及對(duì)照的空載體p SUPER細(xì)胞模型。選取五個(gè)劑量點(diǎn)0、2、4、6、8Gy照射細(xì)胞模型,通過(guò)細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TP53INP1Ri與p SUPER相比6、8Gy照射后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯增加。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TP53INP1Ri與p SUPER細(xì)胞種入九十六孔板內(nèi),給予8 Gy照射,照射前分別加入自噬抑制劑(1mmol/L)3MA和自噬誘導(dǎo)劑(100nmol/L)雷帕霉素,照射后48小時(shí)通過(guò)CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞的存活率,結(jié)果表明,與p SUPER相比,TP53INP1Ri細(xì)胞3MA作用后細(xì)胞增殖效果明顯,雷帕霉素作用后則增值效果無(wú)差異。8Gy照射后24小時(shí)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞自噬和凋亡的變化,結(jié)果顯示,與p SUPER相比,電離輻射后TP53INP1Ri細(xì)胞自噬的發(fā)生率明顯降低,而細(xì)胞凋亡的變化并不明顯。已有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí),TP53INP1的氨基末端部分包含一個(gè)與LC3可以相互作用的一部分區(qū)域(LIR),使得TP53INP1和LC3之間可以相互作用,TP53INP1參與自噬并促進(jìn)自噬性細(xì)胞死亡。電離輻射后這種作用機(jī)制是否存在,我們通過(guò)免疫熒光法發(fā)現(xiàn)8Gy照射后24小時(shí)MCF-7細(xì)胞中TP53INP1與自噬蛋白LC3存在共定位。并且TP53INP1 Ri細(xì)胞在8Gy照射后24小時(shí)其MAPLC3的表達(dá)與p SUPER細(xì)胞相比明顯降低,提示TP53INP1參與電離輻射引起的自噬。4 TP53INP1與p53之間存在相互作用TP53INP1是p53的靶基因,我實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí)電離輻射后p53表達(dá)增加并且調(diào)控DRAM促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬,那么p53是否也與TP53INP1存在相互作用,電離輻射后二者是否存在關(guān)聯(lián)?首先通過(guò)免疫熒光法證實(shí)了電離輻射后TP53INP1與p53在MCF-7細(xì)胞內(nèi)存在共定位。通過(guò)IP(免疫共沉淀法)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)8Gy照射后TP53INP1與p53存在相互作用,但與非照射組相比這種相互作用并無(wú)增強(qiáng)的趨勢(shì)。將沉默TP53INP1的細(xì)胞經(jīng)8Gy照射后Q-PCR和WB結(jié)果表明電離輻射后沉默TP53INP1不能影響p53蛋白的表達(dá)。將沉默p53的細(xì)胞模型經(jīng)8Gy照射后Q-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)電離輻射后沉默p53可降低TP53INP1m RNA的表達(dá),但WB結(jié)果表明沉默p53對(duì)TP53INP1蛋白的表達(dá)影響并不顯著。這些結(jié)果表明電離輻射后p53對(duì)TP53INP1的表達(dá)無(wú)直接影響,可能通過(guò)相互作用發(fā)揮調(diào)控。5 TP53INP1與STAT3之間存在相互作用8Gy照射后24小時(shí)收集TP53INP1Ri和p SUPER細(xì)胞并提取RNA做基因表達(dá)譜芯片,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TP53INP1沉默后STAT3的表達(dá)也降低。為驗(yàn)證這一結(jié)論,通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)得到了證實(shí)。STAT3(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3)作為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與細(xì)胞表面的多肽受體相互作用調(diào)控細(xì)胞外信號(hào)通路如細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,STAT3蛋白主要通過(guò)酪氨酸磷酸化激活轉(zhuǎn)錄,STAT3這個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控超過(guò)1000種基因產(chǎn)物的表達(dá)。那么二者之間是否存在關(guān)聯(lián)未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,為證實(shí)二者之間的關(guān)系,首先通過(guò)免疫熒光法確認(rèn)TP53INP1與STAT3在細(xì)胞內(nèi)共定位,進(jìn)而通過(guò)IP(免疫共沉淀法)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)8Gy照射后TP53INP1與STAT3相互作用與非照射組相比明顯增強(qiáng)。為證實(shí)二者之間是否存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,進(jìn)一步應(yīng)用CHIP染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)STAT3作為轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合在TP53INP1的啟動(dòng)子序列。將MCF-7細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染STAT3si RNA,WB驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行8Gy照射后可降低細(xì)胞內(nèi)TP53INP1的表達(dá)。結(jié)果表明電離輻射后TP53INP1與STAT3之間存在相互作用。結(jié)論:1.電離輻射誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。2.TP53INP1參與電離輻射引起的乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬。3.TP53INP1可通過(guò)STAT3參與電離輻射誘導(dǎo)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9;R730.55

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本文編號(hào)：1640550