本文選題：腸桿菌科細(xì)菌　切入點(diǎn)：質(zhì)粒介導(dǎo)　出處：《昆明理工大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：喹諾酮類藥物(Quinolones)是一類人工合成的廣譜、強(qiáng)效抗菌藥物,是目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗菌藥物。腸桿菌科細(xì)菌(Enterobacteriaceae bacteria)是臨床最常見的分離菌,其中又以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主,近年來腸桿菌科細(xì)菌對(duì)喹諾酮類的耐藥性越來越嚴(yán)重,常常導(dǎo)致臨床治療延遲或失敗。之前的觀點(diǎn)認(rèn)為腸桿菌科的喹諾酮耐藥是由染色體介導(dǎo)的,包括細(xì)胞膜通透性改變、主動(dòng)外排系統(tǒng)和靶基因的改變?nèi)N途徑。后來研究發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)途徑,這很好的解釋了耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的問題。質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類的耐藥基因,包括qnr基因家族和aac(6')-Ib-cr基因等,常與超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases.ESBLs)協(xié)同傳播,且這些基因的分布有地域性差異,研究本地區(qū)質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥機(jī)制研究對(duì)臨床的經(jīng)驗(yàn)性用藥和制定適宜的院感控制措施顯得尤為重要。本文的主要研究工作是昆明地區(qū)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥的機(jī)制,包括以下三個(gè)方面:(1)檢測(cè)PMQR的流行基因2015年5月—2016年7月從云南省第一人民醫(yī)院不同科室、不同年齡段病人,不同感染部位分離出的50株喹諾酮類耐藥的產(chǎn)ESBLs的腸桿菌科細(xì)菌,其中包括26株大腸埃希氏菌和24株肺炎克雷伯菌。設(shè)計(jì)特異的質(zhì)粒耐藥基因引物,對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株提取基因組后,利用PCR技術(shù)檢測(cè)不同菌株質(zhì)粒耐藥基因的攜帶情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌中流行的耐藥基因有所差異,大腸埃希氏菌最流行的是qnrB基因,檢出率高達(dá)88.4%,其次是aac(6')-Ib-cr基因,檢出率為61.5%,qnrD和qnrS基因都只檢測(cè)到了一例。肺炎克雷伯菌中都攜帶qnrB、qnrS和aac(6')-Ib-cr基因,檢出率都為100%。我們還發(fā)現(xiàn)在同一株菌中可能有攜帶幾種不同的質(zhì)粒耐藥基因,大腸埃希氏菌中42.3%菌株攜帶有兩種耐藥基因,7.6%的菌株攜帶有三種耐藥基因。所有的肺炎克雷伯菌都攜帶了三種相同質(zhì)粒耐藥基因。(2)多重耐藥性研究對(duì)攜帶有PMQR基因的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn),大腸埃希氏菌全部接合成功,肺炎克雷伯菌除兩株外,也全部接合成功。這說明攜帶有喹諾酮耐藥基因的質(zhì)粒具有很高的水平轉(zhuǎn)移能力,沒有接合成功的樣品可能是因?yàn)閿y帶耐藥基因的質(zhì)粒缺乏接合相關(guān)的轉(zhuǎn)移操縱子。用E-test的方法檢測(cè)喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類藥物對(duì)接合供體菌、受體菌、接合子的MIC值。我們發(fā)現(xiàn)供體菌和接合子對(duì)喹諾酮類藥物都具有耐藥性,這間接說明耐藥基因是位于質(zhì)粒上的。絕大部分的供體菌和接合子對(duì)氨基糖苷類藥物有耐藥作用,只有一株E.coli供體菌有耐藥作用,而其接合子對(duì)藥物敏感,說明其耐藥基因位于基因組上。供體菌和接合子對(duì)除碳青霉烯類外大多數(shù)的β-內(nèi)酰胺藥物耐藥,說明質(zhì)粒上同樣攜帶了這些藥物的耐藥基因。綜合這些數(shù)據(jù)我們可以得出攜帶有喹諾酮類藥物耐藥基因的質(zhì)粒上,同樣攜帶了氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥基因,造成了腸桿菌科細(xì)菌的多重耐藥作用。(3)腸桿菌科細(xì)菌同源性分析用脈沖電泳技術(shù)分析攜帶有PMQR基因的腸桿菌科細(xì)菌的同源性,有14株大腸埃希氏菌的同源性為85%以上判定為相同菌株來源,占到了總數(shù)的58.3%(14/24),其中有一組兩個(gè)菌株的同源性為100%;肺炎克雷伯菌同源性達(dá)到85%以上的菌株有16株,占到了總數(shù)的66.6%(16/24),其中有5組十株基因組條帶完全一致是為近期傳播的同一菌株,占比為41.6%(10/24),這五組菌株中有四組來自于重癥監(jiān)護(hù)室,說明在免疫力低下病人中,這種耐藥菌傳播更迅速。綜合這些數(shù)據(jù)可以得出質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥,在肺炎克雷伯菌中的流行爆發(fā)相對(duì)于大腸埃希氏菌更集中,耐藥菌在免疫力低下病人中傳播更迅速。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在昆明地區(qū)臨床分離腸桿菌科菌中最流行的PMQR基因是qnrB、qnrS和aac(6')-Ib-cr,且這些基因水平傳播能力很強(qiáng),攜帶有PMQR基因的質(zhì)粒上同時(shí)攜帶有其他多種藥物的耐藥基因,同源性分析發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的流行暴發(fā)相對(duì)于大腸埃希氏菌更集中,免疫力低下病人中傳播更迅速,這些結(jié)果對(duì)本地區(qū)耐藥基因庫(kù)的建立,臨床耐藥菌的控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Quinolones (Quinolones) is a kind of synthetic broad-spectrum, potent antibacterial drugs, is currently the most widely used clinical antibiotics. Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae bacteria) is the most common clinical isolates, including Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, drug resistance and Enterobacteriaceae in recent years bacteria to quinolones is more serious, often leads to clinical treatment delay or failure. Before the view of quinolone resistant Enterobacteriaceae is mediated by the chromosome, including cell membrane permeability, three ways of active efflux system and target genes. Then the study found that the plasmid mediated quinolone resistance (plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR), which is a good explanation of the horizontal transfer of antibiotic resistance genes. The plasmid mediated quinolone resistance genes, including qnr gene family And group AAC (6') -Ib-cr gene, often amides with extended spectrum beta enzyme (extended-spectrum beta -lactamases.ESBLs) collaborative communication, and regional differences in the distribution of these genes, the research region of plasmid mediated quinolone resistance mechanism is particularly important for clinical empiric therapy and formulating appropriate control measures is the hospital. The main research work of this paper is the mechanism of quinolone resistance in Kunming producing ESBLs Enterobacteriaceae Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae plasmid mediated, including the following three aspects: (1) May 2015 - detection of PMQR genotype in July 2016 from the first people's Hospital of Yunnan province from different departments. Patients of different ages, 50 strains of quinolone resistance in different infection sites of the isolated ESBLs producing Enterobacteriaceae strains, including 26 strains of Escherichia coli and 24 strains of Klebsiella pneumonia Strain. Plasmid resistant gene specific primer design, the strain was extracted after detecting different plasmid carrying resistance genes by using PCR technology, the difference has popular resistance gene in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli and Salmonella is the most popular qnrB gene, detection rate up to 88.4%, followed by AAC (6') -Ib-cr gene, the detection rate was 61.5%, qnrD and qnrS genes were detected only one case. Klebsiella pneumoniae carried qnrB, qnrS and AAC (6') -Ib-cr gene, the detection rate is 100%. we also found in the same strains may there are several different plasmids carrying resistance genes, 42.3% strains of Escherichia coli carrying two resistant genes, 7.6% strains carrying three resistant genes. All Klebsiella pneumoniae had three different plasmid resistance genes. (2) multi drug resistance research To carry the Enterobacteriaceae PMQR gene plasmid conjugation experiments, Escherichia coli engages all successful, Klebsiella pneumoniae in two strains, all joined successfully. This shows that carrying the plasmid of quinolone resistance gene has a high level of ability to transfer, no joint success is possible because the plasmid carrying samples the lack of resistance genes related to quinolones. Conjugative transfer operon detection using E-test method, beta lactam and aminoglycoside drugs on the donor receptor bacteria, bacteria, zygote MIC value. We found that donor and TRANSCONJUGANT are resistant to quinolones, which indirectly indicated that the resistance gene is located on plasmids the vast majority of bacteria. The donor and TRANSCONJUGANT resistant to aminoglycosides, only a E.coli donor drug resistance, and the zygote is sensitive to medicine and instructions The resistance gene in genome. The donor and TRANSCONJUGANT of carbapenem most beta lactam drug resistance, plasmid that also carry resistance genes of these drugs. The combination of these data we can conclude that carrying the plasmid quinolone resistance gene, also carry aminoglycoside resistance gene and beta lactam drugs, caused by the multiple drug resistance of Enterobacteriaceae. (3) analysis with Enterobacteriaceae homology of PMQR gene by pulsed field gel electrophoresis, a bacterial homologue of Enterobacteriaceae, 14 strains of Escherichia coli was 85% homologous to the above decision for the same strain the source, accounted for 58.3% of the total (14/24), including a group of two strains was 100% homology; Klebsiella pneumoniae homology more than 85% strains 16 strains accounted for 66.6% of the total (16/24), the There are 5 groups of ten genomic bands identical for recent spread of the same strain, accounted for 41.6% (10/24), the five groups of strains in four group from the ICU, in immunocompromised patients, the resistant bacteria spread more quickly. These data can be obtained by quinolone resistance plasmid mediated, in Klebsiella pneumoniae in Escherichia coli outbreaks compared to the more concentrated, drug resistant bacteria in immunocompromised patients spread more quickly. In summary, this study found that the most popular PMQR gene in clinical isolates of Enterobacteriaceae in Kunming area is qnrB, qnrS and AAC (6') -Ib-cr. And these gene horizontal transmission ability is very strong, carrying the plasmid PMQR gene and carrying resistance genes in a variety of other drugs, the homology analysis showed that Klebsiella pneumoniae epidemic outbreaks of Escherichia coli with more concentrated immune These results provide an experimental basis for the establishment of drug-resistant gene banks in the region and the control of clinical drug resistant bacteria.

【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R446.5

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本文編號(hào)：1610232