本文選題：基因治療　切入點(diǎn)：大豆蛋白　出處：《安徽大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：基因缺失和異常常導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生,包括癌癥,心血管疾病,遺傳病等,這些疾病嚴(yán)重危害著人類的生命健康�；蛑委熥鳛橐环N新型的生物治療手段,因其能夠安全、準(zhǔn)確、有效的修正異變基因而備受關(guān)注。然而,如何設(shè)計(jì)適合的載體將目的基因高效、準(zhǔn)確地運(yùn)載到靶細(xì)胞中仍然是目前研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。聚乙烯亞胺(PEI)是普遍應(yīng)用的陽(yáng)離子聚合物基因載體之一,因其質(zhì)子化之后具有高的電荷密度和良好的質(zhì)子緩沖能力。其中,高枝化度后的PEI 25 KDa和22 KDa擁有高的轉(zhuǎn)染效率,因而被稱作聚陽(yáng)離子基因載體領(lǐng)域中的"黃金準(zhǔn)則"。但是高分子量PEI細(xì)胞毒性大,生物降解能力差,易與血清蛋白結(jié)合等嚴(yán)重制約了其作為基因載體的應(yīng)用。另一方面,低分子量的PEI盡管細(xì)胞毒性弱,但是轉(zhuǎn)染效率低,有些甚至幾乎沒(méi)有轉(zhuǎn)染效率。為了解決低分子量PEI轉(zhuǎn)染效率低的問(wèn)題,近年來(lái)研究人員對(duì)低分子量PEI進(jìn)行了多方面的研究。本論文基于天然大分子大豆分離蛋白為起始原料制備出一類簡(jiǎn)單、可生物降解、高效的的聚陽(yáng)離子基因載體。首先對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行酶解,接著離心和透析純化,得到具有良好水溶性的低分子量大豆蛋白(SP)。將不同低分子量的PEI(600 Da,1200 Da,1800 Da)通過(guò)酰胺化反應(yīng)修飾在大豆蛋白上得到一系列大豆蛋白-PEI復(fù)合產(chǎn)物(SP-PEIs),分別命名為SP-PEI600,SP-PEI1200,SP-PEI1800。經(jīng)過(guò)紅外和Zeta電位等實(shí)驗(yàn)證實(shí),不同低分子量PEI成功地接枝到大豆蛋白上。通過(guò)酸堿滴定實(shí)驗(yàn)證明聚合物SP-PEIs的質(zhì)子緩沖能力,通過(guò)蛋白吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聚合物SP-PEIs對(duì)血清蛋白的抑制作用。接下來(lái),復(fù)合物SP-PEIs/DNA的理化性質(zhì)得到進(jìn)一步詳細(xì)研究。聚合物與DNA形成的復(fù)合物具有理想的粒徑和電位有利于其快速進(jìn)入細(xì)胞和提高基因轉(zhuǎn)染。在pH為7.4的生理?xiàng)l件下,SP-PEIs與DNA形成的復(fù)合物隨著N/P質(zhì)量比的增加,復(fù)合物的粒徑逐漸發(fā)生改變,最終會(huì)穩(wěn)定在100-200nm左右,復(fù)合物SP-PEIs/DNA的電位也是隨著N/P質(zhì)量比的增大而增長(zhǎng)。檢測(cè)不同pH下復(fù)合物SP-PEIs/DNA粒徑的變化,發(fā)現(xiàn)其在生理?xiàng)l件下(pH=7.4)可以穩(wěn)定存在,在酸性條件下粒徑發(fā)生明顯變化,該特性有助于復(fù)合物上中的DNA從內(nèi)涵體中逃逸出來(lái)。另外,通過(guò)瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聚合物SP-PEIs對(duì)DNA的壓縮能力,DNase I降解實(shí)驗(yàn)和肝素置換實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步檢測(cè)聚合物對(duì)DNA的壓縮能力。之后,通過(guò)一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了聚合物SP-PEIs作為基因載體的潛力和優(yōu)勢(shì)。枝化的PEI 25 KDa作為對(duì)照組,體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,在人腎上皮細(xì)胞(293T)、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)共培養(yǎng)中,聚合物SP-PEIs均表現(xiàn)出比對(duì)照組PEI 25 KDa更低的毒性及良好的生物相容性。利用流式細(xì)胞儀和熒光倒置顯微鏡檢測(cè)SP-PEIs/DNA復(fù)合物在有血清和無(wú)血清環(huán)境下的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果證明,無(wú)論在有血清和無(wú)血清條件下復(fù)合物SP-PEIs/DNA在SH-SY5Y細(xì)胞系均有較高的轉(zhuǎn)染效率。特別是聚合物SP-PEI1800與DNA在質(zhì)量比為24時(shí),無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染效率(5.27%)是對(duì)照組(1.94%)的2.7倍,在有血清條件下則高達(dá)3.4倍;而在293T細(xì)胞中,無(wú)血清條件下聚合物SP-PEI1800與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為24的時(shí)候最高轉(zhuǎn)染效率(15.1%)和對(duì)照組的轉(zhuǎn)染效率(16.6%)幾乎相當(dāng);同樣的在有血清狀態(tài)下,聚合物SP-PEI1800(8.19%)也能取得和對(duì)照組類似的轉(zhuǎn)染效率(7.22%)。本論文制備的復(fù)合物SP-PEIs作為新型的基因載體,具有較低的細(xì)胞毒性,良好的生物相容性,同時(shí)能夠降低血清蛋白的吸附,提高DNA在細(xì)胞中的的穩(wěn)定性,并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染效率的提升。因此,在基因治療的應(yīng)用中,聚合物SP-PEIs作為基因載體擁有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:Gene deletion and abnormality often cause many diseases, including cancer, cardiovascular disease, genetic diseases, these diseases seriously endanger human health. Gene therapy is a new biological treatment, because it can be safe, accurate and effective correction of abnormal gene and concern. However, how to design suitable the carrier of the gene efficiently and accurately carried to the target cell is still the focus and difficulty in the present study. Polyethyleneimine (PEI) is one of the commonly used cationic polymer gene carrier, due to the protonation of with high charge density and good proton buffering capacity. Among them, the high branched PEI after 25 KDa and 22 KDa has high transfection efficiency, which is called the polycation gene carrier in the field of "gold standard". But the molecular weight of PEI cell toxicity, biodegradation ability is poor, and the serum Protein binding restrict its application as a gene carrier. On the other hand, the low molecular weight PEI despite weak cytotoxicity, but the transfection efficiency is low, some even almost no transfection efficiency. In order to solve the problem of low molecular weight PEI low transfection efficiency, in recent years, researchers of the low molecular weight of PEI the raw materials for the preparation of this paper. A kind of simple natural macromolecules based on soy protein isolate, biodegradable, high efficient cationic gene vector. Firstly, isolated soybean protein was hydrolyzed, then purified by centrifugation and dialysis, low molecular weight of soybean protein has good water solubility (SP). Different low molecular weight PEI (600 Da, 1200 Da, 1800 Da) through amidation reaction to obtain a series of modified soybean protein products in soybean protein composite -PEI (SP-PEIs), named as SP-PEI600, SP-PEI1200, SP-PEI1 800. by IR and Zeta potential experiments confirmed that different low molecular weight PEI was successfully grafted onto the soybean protein. The proton buffering capacity of acid-base titration experiments show that polymer SP-PEIs, the protein adsorption inhibition of polymer SP-PEIs assay on serum protein. Next, further detailed study of the physicochemical properties of SP-PEIs/DNA composites. The formation of complex polymer and DNA has ideal particle size and zeta potential for its rapid entry into the cell and enhance the gene transfection. At pH 7.4 under physiological conditions, the formation of complex SP-PEIs and DNA increased with the increase of N/ P mass ratio, composite particle size gradually changed, will eventually stabilize at 100-200nm about the potential of compound SP-PEIs/DNA is increased with increase of N/P mass ratio and detection. Different pH SP-PEIs/DNA complex changes in particle size, found under physiological conditions (pH= 7.4) can be stable under acidic conditions, particle size change, contribute to the complex on the properties of DNA endosomal escape. In addition, the polymer SP-PEIs agarose gel electrophoresis detection experiments on DNA compression capability, DNase I degradation and heparin replacement experiment is further detected on compression capability of polymer DNA. After that, through a series of experiments to further evaluate the cell polymer SP-PEIs as gene vector potential and advantages. The branched PEI 25 KDa as control group, showed that the in vitro cytotoxicity in human renal epithelial cells (293T), human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) cultured in polymer SP-PEIs showed compared with the control group PEI 25 KDa low toxicity and good biocompatibility. By using flow cytometry and fluorescence microscope to detect SP-PEIs/DNA complexes in serum and serum-free environment Transfection efficiency. The results show that both in serum and serum free conditions of transfection efficiency under complex SP-PEIs/DNA in SH-SY5Y cell line was higher. Especially the polymer SP-PEI1800 and DNA in the ratio was 24, the transfection efficiency under serum-free conditions (5.27%) and control group (1.94%) is 2.7 times that in serum it is up to 3.4 times; and in 293T cells in serum-free conditions of polymer SP-PEI1800 and plasmid DNA mass ratio is 24 when the highest transfection efficiency (15.1%) and the control group transfection efficiency (16.6%) is almost the same in serum; under the condition of polymer SP-PEI1800 (8.19%) and the control can be achieved group similar transfection efficiency (7.22%). The preparation of compound SP-PEIs as a gene vector model, have low cytotoxicity and good biocompatibility, and can reduce the adsorption of serum proteins in the cell, improve DNA stability It is qualitative and promotes the enhancement of gene transfection efficiency. Therefore, in the application of gene therapy, polymer SP-PEIs has a great potential application value as a gene carrier.

【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R450

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