本文選題：H7N9禽流感病毒　切入點：神經(jīng)氨酸酶　出處：《中國疾病預防控制中心》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人感染H7N9亞型禽流感病毒于2013年在中國長三角地區(qū)首次報道,可引起嚴重的下呼吸道感染癥狀。由于病毒每年持續(xù)廣泛流行于該區(qū)域的家禽中,會在一定范圍內(nèi)感染人類,所以成為人們廣泛關注的公共衛(wèi)生問題。截至2017年5月28日,已有1514例人感染H7N9禽流感的實驗室確診病例。2016年底的第五波流行中,在家禽和人中同時檢測到了高致病性H7N9病毒的存在,病毒HA抗原發(fā)生了變化。簡便、高效的病原快速診斷和治療策略有助于及時采取防控措施以控制疫情擴散,并使患者及時獲得抗病毒治療以改善預后。神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)是流感病毒表面重要的抗原之一,以四聚體形式存在,它能夠切割唾液酸受體,幫助新生病毒顆粒釋放和傳播。NA單體分為胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)、莖部區(qū)和頭部區(qū)四部分,頭部含有抗原表位和酶活性位點,在體內(nèi)可作為抗原誘導體液免疫應答,產(chǎn)生抗體。靶向NA的抗體在體內(nèi)和體外具有保護作用,部分抗體能夠抑制神經(jīng)氨酸酶活性,通過空間干擾等方式作用于NA,從而減輕流感病毒感染時的臨床癥狀。本研究利用雜交瘤技術制備了多株針對H7N9流感病毒神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)的單克隆抗體,并對這些單克隆抗體的功能特性進行了鑒定;基于單抗的特性,又利用其中兩株N9特異性單抗3C1和3E9,建立了雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)捕獲N9亞型禽流感病毒抗原的特異性快速檢測方法,為H7N9禽流感病毒的診斷和防控提供了一個良好的材料。本課題研究結(jié)果如下:一、抗H7N9亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶單克隆抗體的制備及鑒定1.通過小鼠免疫、細胞融合以及間接ELISA篩選方法得到25株H7N9亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶特異性單克隆抗體。2.25 株單抗分別與 rgH6N2、rgH6N9、rgH9N2 及 A/Environment/Jiangxi/28/2009(H1 1N9)病毒進行神經(jīng)氨酸酶抑制實驗。重組病毒rgH6N2、rgH6N9、rgH9N2的NA分別來自 A/Brisbane/10/2007(H3N2),A/Anhui/1/2013(H7N9)以及 A/Hong Kong/33982/2009(H9N2)。25株抗體對rgH6N9、H11N9、rgH9N2和rgH6N2的神經(jīng)氨酸酶抑制活性不同,22 株對 rgH6N9 和 H11N9 的 IC50 為1.6～100μg/ml;對 rgH9N2 的 IC50 為15～100μg/ml,對 rgH6N2 則完全沒有抑制,IC50 都100μg/ml。3.從25株單抗中挑選3株單抗(1G8、3C4和4E8)進行了詳細的功能鑒定,三株單抗為Anhui/1-N9識別特異性的;3C4和4E8具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性,IC50分別為1.45μg/ml 和 8.65μg/ml;競爭 ELISA 顯示三株抗體對 A/Anhui/1/2013(H7N9)的 N9蛋白的結(jié)合表位各不同。二、禽流感病毒N9抗原檢測方法的建立1.通過熒光標記抗體配對平臺篩選出2株單抗(3C1和3E9)用于組建基于雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)的N9抗原檢測方法。2.DAS-ELISA對N9抗原的檢測表現(xiàn)出高敏感性。用重組病毒rgH6N9、野生型病毒A/Environment/Jiangxi/28/2009(H11N9)以及重組 N9 蛋白對 DAS-ELISA 的靈敏度進行了測試,系統(tǒng)對rgH6N9和H11N9的最低檢測閾值為0.125血凝單位/50μl;N9標準曲線呈線性反應關系,最低檢測限為6.25ng/ml。3.用重組病毒rgH6N1、rgH6N2以及rgH9N2對DAS-ELISA的特異性進行了測試,當固定病毒用量都為8血凝單位/50μl時,檢測不出任何陽性信號,表現(xiàn)出高特異性。4.使用咽拭子樣本評估DAS-ELISA在臨床應用的可行性。DAS-ELISA檢測五份Q-PCR確診的H7N9樣本,兩份顯示陽性信號;同時用商品化H7亞型流感病毒檢測試劑盒(膠體金法)檢測樣本,全部未檢出陽性信號。結(jié)論1.制備獲得25株N9特異性單克隆抗體,其中22株顯示出神經(jīng)氨酸酶抑制活性,IC50 為1.6～15μg/ml。2.用N9特異性抗體組建了雙抗體夾心ELISA法,表現(xiàn)出高敏感性和特異性,可用于檢測H7N9病毒或N9蛋白和臨床樣本。
[Abstract]:People infected with H7N9 subtype avian influenza virus was first reported in 2013 in the Yangtze River Delta region Chinese, can cause severe lower respiratory tract infection symptoms. Because the virus last year is widely popular in the area of poultry, infect humans in a certain range, so become a public health problem of concern. As of May 28, 2017, the fifth wave of popular 1514 people have been infected with H7N9 avian influenza cases of laboratory confirmed cases of.2016 at the end of the year, in poultry and people was detected for the highly pathogenic H7N9 virus has changed virus HA antigen. The pathogen is simple, high efficiency and rapid diagnosis and treatment strategies help to take timely prevention and control measures to control the spread of the epidemic, and the patients receive timely antiviral treatment to improve the prognosis. The neuraminidase (Neuraminidase, NA) is one of the major surface antigen of influenza virus, with four dimers form it Can cut sialic acid receptors, help new virus particles release and spread of.NA monomer into the intracellular region, transmembrane region, stem region and head area of four parts, the head containing the epitope and enzyme activity, in vivo can be used as antigen to induce humoral immune response, antibody targeting NA antibody. In vivo and in vitro has a protective effect, part of the antibody can inhibit the activity of neuraminidase, by way of spatial interference in NA, so as to reduce the clinical symptoms of influenza virus infection. This study was prepared for H7N9 strains of influenza virus neuraminidase by hybridoma technology (Neuraminidase, NA) monoclonal antibody, and functional properties of the monoclonal antibodies were identified; monoclonal antibody based on the characteristics of the two strains of N9 specific monoclonal antibody 3C1 and 3E9, a double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) acquisition of N9 subtype avian influenza virus antigen Method for rapid detection of specificity, provides a good material for the diagnosis and prevention of H7N9 avian influenza virus. The results of this study are as follows: first, the monoclonal antibody of H7N9 subtype influenza virus neuraminidase preparation and identification of 1. mice by immunization, cell fusion and indirect ELISA screening method of 25 strains of H7N9 subtype influenza virus neuraminidase specific monoclonal antibody McAb.2.25 respectively with rgH6N2, rgH6N9, rgH9N2 and A/Environment/Jiangxi/28/2009 (H1 1N9) virus neuraminidase inhibition assay. The recombinant virus rgH6N2, rgH6N9, rgH9N2 NA from A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Anhui/1/2013 (H7N9) and A/Hong Kong/33982/2009 (H9N2) H11N9.25 antibodies to rgH6N9, neuraminidase. RgH9N2 and rgH6N2 inhibitory activity, 22 strains of rgH6N9 and H11N9 IC50 was 1.6 ~ 100 g/ml; rgH9N2 I C50 is 15~100 g/ml, the rgH6N2 has no inhibition of IC50 100 g/ml.3. from the 25 mAbs selected 3 monoclonal antibodies (1G8,3C4 and 4E8) were identified with the function, the three strains of monoclonal antibodies to Anhui/1-N9 specific identification; 3C4 and 4E8 with neuraminidase inhibitory activity, g/ml and IC50 were 1.45 8.65 g/ml; competitive ELISA showed that three strains of antibodies to A/Anhui/1/2013 (H7N9) N9 protein binding to different epitopes. Two, detection of avian influenza virus N9 antigen by 1. fluorescent antibody pairing platform screened 2 strains of monoclonal antibody (3C1 and 3E9) for the formation of double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) based on.2.DAS-ELISA detection of N9 antigen of N9 antigen detection showed Gao Min sensibility. With the recombinant virus rgH6N9, wild type virus A/Environment/Jiangxi/28/2009 (H11N9) and the sensitivity of the recombinant N9 protein of DAS-ELISA were measured Try, the lowest detection threshold of rgH6N9 and H11N9 0.125 blood coagulation unit /50 L; linear response relationship N9 standard curve, the lowest detection limit for the recombinant virus with 6.25ng/ml.3. rgH6N1 specific rgH6N2 and rgH9N2 on DAS-ELISA were measured, when the dosage is 8 fixed virus hemagglutination unit /50 L NO, not a positive signal detection, showed high specificity to.4. using swab samples to assess feasibility of DAS-ELISA in.DAS-ELISA clinical application of detection of five Q-PCR H7N9 were two samples showed positive signals; simultaneously with the commercialization of H7 subtype influenza virus detection kit (colloidal gold) of all test samples. No positive signal was detected. Conclusion 1. obtained 25 strains of N9 specific monoclonal antibodies, of which 22 strains showed neuraminidase inhibitory activity, IC50 was 1.6 ~ 15 g/ml.2. with N9 specific antibody and a double antibody sandwich ELISA method, It shows Gao Min's sensibility and specificity, which can be used to detect H7N9 virus or N9 protein and clinical samples.

【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R511.7;R446.6

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