本文關(guān)鍵詞： 中性粒細(xì)胞亞群 CXCR4 老年膿毒癥 Treg細(xì)胞 歸巢效應(yīng)　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：膿毒癥(sepsis)是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng),尤其老年人免疫功能發(fā)生變化,對(duì)膿毒癥的易感性增加,罹患相對(duì)危險(xiǎn)是年輕者的13.1倍。老齡膿毒癥患者可進(jìn)一步發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥及膿毒性休克。嚴(yán)重膿毒癥病情進(jìn)展快,預(yù)后差,是臨床危重患者最主要的死亡原因之一。盡管目前抗生素治療和外科技術(shù)等有了很大地提升,膿毒癥病死率仍然很高。已知膿毒癥是多種細(xì)胞和介質(zhì)參與的復(fù)雜反應(yīng)。越來越多的研究證明中性粒細(xì)胞參與了膿毒癥的炎癥反應(yīng)并在其中起協(xié)同作用。中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的最關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞,在宿主對(duì)感染的第一道防線中起到至關(guān)重要的作用。中性粒細(xì)胞具有廣泛的防御感染入侵的功能。之前的研究表明,巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等各類免疫細(xì)胞可以分化成不同功能的表型。最近有研究指出,循環(huán)中存在相似的不同功能表型的中性粒細(xì)胞。他們基于CD16(FcγRIII受體)和CD62L(L-選擇蛋白)表達(dá)的不同分為不同的中性粒細(xì)胞亞群。除成熟中性粒細(xì)胞(CD16~(high) CD62Lhigh)外,還有兩個(gè)不同的中性粒細(xì)胞亞群:未成熟中性粒細(xì)胞(CD16low CD62Lhigh)和抑制中性粒細(xì)胞(CD16~(high) CD62~(Llow))。未成熟的中性粒細(xì)胞可能在成熟中性粒細(xì)胞從骨髓中消耗之后出現(xiàn),并在抗微生物免疫功能中被認(rèn)為是無效的細(xì)胞類型。抑制中性粒細(xì)胞被認(rèn)為能夠抑制T細(xì)胞增殖,并在減輕嚴(yán)重炎癥反應(yīng)中起重要作用。然而,中性粒細(xì)胞如何在感染后迅速到達(dá)感染灶中呢?趨化因子在其中發(fā)揮著巨大作用。趨化因子是一類相對(duì)分子質(zhì)量為8000~15000的小分子炎性細(xì)胞因子,通過與細(xì)胞表面的相關(guān)受體結(jié)合,在炎性細(xì)胞活化和遷移過程中發(fā)揮重要作用。SDF-1是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞持續(xù)分泌的一種炎性趨化因子,也是唯一能與趨化因子受體CXCR4結(jié)合并激活的天然趨化因子。SDF-1與CXCR4廣泛地表達(dá)于多種細(xì)胞和組織中,并在細(xì)胞的動(dòng)員、遷移、增殖和存活中起著至關(guān)重要的作用。基于體內(nèi)中性粒細(xì)胞活化在炎癥環(huán)境中的存在,我們通過研究中性粒細(xì)胞不同亞群的功能,探討抑制性中性粒細(xì)胞亞群在老齡膿毒癥患者免疫抑制中的作用機(jī)制,為老齡膿毒癥的研究提供新的研究靶點(diǎn)。本課題擬采用臨床老年膿毒癥患者血液樣本和老齡膿毒癥小鼠各個(gè)組織器官樣本闡述不同中性粒細(xì)胞亞群的不同分化功能,研究CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群和CXCR4與膿毒癥患者預(yù)后的相關(guān)性,以及CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群通過CXCR4在老齡膿毒癥患者免疫抑制中對(duì)Treg細(xì)胞調(diào)控的機(jī)制。最后從中性粒細(xì)胞亞群的穩(wěn)態(tài)、釋放以及回巢各個(gè)角度探討調(diào)控CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow CXCR4high中性粒細(xì)胞對(duì)22月齡的老齡膿毒癥小鼠各個(gè)器官的保護(hù)作用,為臨床診斷、治療膿毒癥提供新的靶點(diǎn)和思路。實(shí)驗(yàn)方法第一部分l.通過梯度離心法分選老年健康志愿者外周血中性粒細(xì)胞,并通過免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。2.LPS刺激膿毒癥患者和老年健康志愿者外周血中性粒細(xì)胞后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞表型的變化規(guī)律。3.分析老年膿毒癥患者外周血CD15~+CD16~+亞群比例分配。4.分析老年膿毒癥患者外周血中性粒細(xì)胞各亞群中CD11b和CD64的表達(dá)情況。5.CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群和CXCR4與老年膿毒癥患者預(yù)后相關(guān)性。第二部分l.通過流式細(xì)胞分選方法,分選出老年膿毒癥患者CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群,以不同比例與健康老年志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng),分析其對(duì)不同T淋巴細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。2.通過ELISA法檢測(cè)IFN-γ和IL-6細(xì)胞因子表達(dá)水平。3.老年膿毒癥患者CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群與健康老年志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)后,用流式細(xì)胞術(shù)方法分析其對(duì)不同亞群Treg細(xì)胞的調(diào)控作用。4.通過流式細(xì)胞術(shù)方法分析不同抑制劑處理后CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。第三部分1.通過流式細(xì)胞術(shù)方法分析老齡膿毒癥小鼠外周血中性粒細(xì)胞亞群的功能以及Gr-1~+Ly6Clow CD11bhigh CD62~(Llow)隨著老齡重癥膿毒癥小鼠病情變化的表達(dá)情況。2.通過流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)老齡小鼠在建立膿毒癥模型前后血、骨髓、脾臟、肺臟、肝臟、腎臟中抑制性中性粒細(xì)胞亞群含量的變化。3.通過流式細(xì)胞術(shù)方法分析阻斷CXCR4后,老齡膿毒癥小鼠血、骨髓、脾臟、肺臟、肝臟、腎臟中抑制性中性粒細(xì)胞亞群與未處理組比較的差異。4.探討阻斷CXCR4和氧化應(yīng)激后對(duì)老齡重癥膿毒癥小鼠7天生存率的影響。結(jié)果第一部分1.老年膿毒癥患者早期外周血抑制性中性粒細(xì)胞亞群CD16~(high)CD62~(Llow)和未成熟中性粒細(xì)胞亞群CD16low CD62Lhigh比例明顯高于老年健康志愿者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。而CD16~(high) CD62Lhigh和CD16low CD62~(Llow)表達(dá)組間無顯著差異。2.LPS刺激老年健康志愿者中性粒細(xì)胞,CD16~(high) CD62~(Llow)和CD16low CD62Lhigh比例比未刺激組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。而CD16~(high) CD62Lhigh表達(dá)無組間顯著差異。3.分析老年膿毒癥患者外周血CD16~+亞群比例,CD16hig h CD62Lhigh亞群占CD16~+亞群比例最少;CD16~(high) CD62~(Llow)亞群,CD16low CD62~(Llow)亞群、CD16low CD62Lneg亞群和CD16~(high) CD62Lneg亞群占CD16~+亞群比例較高,其中CD62Lneg所占比列最高,組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.老年膿毒癥患者全血中性粒細(xì)胞CD16~+亞群中CD11b和CD64的表達(dá)情況顯示:CD16~(high) CD62~(Llow)亞群CD11b和CD64表達(dá)比例最高。5.CD16low CD62Lhigh亞群和CD16~(high) CD62~(Llow)亞群與APACHEⅡ評(píng)分成正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。。6.老年膿毒癥死亡組APACHEⅡ評(píng)分,血乳酸值和CD16~(high) CD62~(Llow) CXCR4high亞群的比例均高于老年膿毒癥存活組,膿毒癥休克組APACHEⅡ評(píng)分和血乳酸值均高于膿毒癥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。CD16~(high) CD62~(Llow) CXCR4high亞群表達(dá)與死亡率成正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。第二部分1.將老年膿毒癥患者不同比例的CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群與健康老年志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng),均產(chǎn)生劑量依賴性的抑制T淋巴細(xì)胞增殖的效應(yīng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.以2:1比例混合培養(yǎng)CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群與健康老年志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞后,IFN-γ和IL-6表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.以2:1比例混合培養(yǎng)CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群與健康老齡志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞后,Treg細(xì)胞的表達(dá)增加,效應(yīng)Treg細(xì)胞亞群表達(dá)增加和幼稚Treg亞群表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群通過CXCR4和氧化應(yīng)激介導(dǎo)對(duì)T淋巴細(xì)胞調(diào)控效應(yīng)。第三部分1.隨著老齡膿毒癥小鼠病程的延長(zhǎng),Gr-1~+Ly6Clow CD11bhigh CD62~(Llow)與Gr-1~+Ly6Chigh CD11blow CD62Lhigh比例逐漸增加。隨著老齡膿毒癥小鼠病情不斷嚴(yán)重,CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow CXCR4high表達(dá)逐漸增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2.與健康老齡小鼠相比,內(nèi)毒素血癥引起小鼠血液、肝臟、肺和腎臟中積累的抑制性嗜中性粒細(xì)胞CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow數(shù)量顯著升高,反而骨髓中抑制性嗜中性粒細(xì)胞CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow數(shù)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。當(dāng)阻斷CXCR4信號(hào)后,與內(nèi)毒素血癥小鼠相比,阻斷后引起小鼠血液、肝臟、肺和腎臟中積累的抑制性嗜中性粒細(xì)胞CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow數(shù)量顯著降低,而骨髓中抑制性嗜中性粒細(xì)胞CD11bhigh CD62~(Llow) Ly6Clow數(shù)量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。3.阻斷CXCR4和氧化應(yīng)激信號(hào)后可以明顯提高重度膿毒癥小鼠7天內(nèi)的生存率。結(jié)論1.老年膿毒癥患者外周血中性粒細(xì)胞亞群CD16~(high) CD62~(Llow) CXCR4high與膿毒癥患者病情嚴(yán)重性和死亡率呈正相關(guān)。2.CD16~(high) CD62~(Llow)中性粒細(xì)胞亞群在老年膿毒癥患者中通過CXCR4使其效應(yīng)性和幼稚型Treg細(xì)胞亞群功能增強(qiáng)。3.阻斷CXCR4信號(hào)介導(dǎo)老齡膿毒癥小鼠抑制性中性粒細(xì)胞亞群歸巢效應(yīng),同時(shí)提高老齡重癥膿毒癥小鼠生存率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R459.7

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