本文關(guān)鍵詞：ST37型艱難梭菌耐藥特征及其應(yīng)用MALDI-TOF MS快速鑒定方法的建立　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:艱難梭菌(Clostridium difficile,CD)是一種專性厭氧,革蘭陽性的粗大芽孢桿菌,是引起抗生素相關(guān)性腹瀉(AAD)和院內(nèi)感染的主要病原菌。艱難梭菌導(dǎo)致人類腹瀉的主要致病機制與該菌產(chǎn)生的兩種毒素有關(guān),腸毒素A(Tcd A)和細(xì)胞毒素B(Tcd B)。高產(chǎn)毒株核糖體(RT)027型菌株能夠產(chǎn)生第三種毒素——二元毒素(CDT)。近年來,RT027型等高產(chǎn)毒株的出現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致北美和歐洲地區(qū)醫(yī)院內(nèi)的多次暴發(fā)流行。而亞洲地區(qū)分離率最高的型別主要是RT017型,即多位點序列分型(MLST)37型。ST37型艱難梭菌僅產(chǎn)生毒素B,不產(chǎn)生毒素A,卻仍有很強的致病性。相比其他型別,ST37型艱難梭菌對氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)脂類、林可霉素類等多種抗生素的耐藥率明顯增高,是引起成人艱難梭菌感染(CDI)最主要的型別。由ST37型艱難梭菌感染導(dǎo)致的嚴(yán)重臨床癥狀和暴發(fā)流行時有報道,對公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅。因此,快速鑒定ST37型艱難梭菌對預(yù)防我國艱難梭菌暴發(fā)流行至關(guān)重要。目前,常用的分型方法有PCR-核糖體分型、MLST和脈沖場凝膠電泳分型(PFGE)等,但是由于這些方法耗時長、價格昂貴,且需要使用專門儀器設(shè)備,很難在臨床實驗室中常規(guī)應(yīng)用。本研究建立了一種基于基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)快速檢測ST37型艱難梭菌的方法,將對艱難梭菌感染的防控起到重要作用。方法:159株菌種均來自河北省醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心(HBCMCC)。其中,65株收集于腹瀉患者,87株收集于健康成人或兒童,另外包含7株標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC BAA-1870,ATCC BAA-1382,ATCC BAA-1812,ATCC BAA-1804,ATCC 9689,ATCC 43255和ATCC 43598)。159株菌通過MALDI-TOF MS和16s r DNA測序均被鑒定為艱難梭菌。將實驗用所有菌株接種于哥倫比亞血瓊脂平板,傳代兩次,用于后續(xù)試驗。提取艱難梭菌基因組進行艱難梭菌毒素基因檢測以及MLST分型。采用CLSI推薦的瓊脂稀釋法檢測艱難梭菌對臨床常用藥物的最低抑菌濃度(MIC),共包括13種抗生素:萬古霉素、甲硝唑、非達(dá)霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、利福昔明、美羅培南和克林霉素。菌體蛋白的提取采用乙醇/甲酸法。提取出的蛋白樣本通過Microflex LT和VITEK MS兩臺質(zhì)譜儀采集質(zhì)譜數(shù)據(jù),通過Clinprotools軟件分析建立ST37型艱難梭菌快速鑒定方法,并對該方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性進行驗證。結(jié)果:1毒素基因檢測結(jié)果顯示:159株艱難梭菌中,104株為tcd A+tcd B+cdt A-cdt B-,4株為tcd A+tcd B+cdt A+cdt B+,21株為tcd A-tcd B+cdt A-cdt B-,30株為非產(chǎn)毒株tcd A-tcd B-cdt A-cdt B-。MLST分型將所有菌株分為46個ST型,其中最主要的型別為ST3,其次為ST37、ST54、ST2和ST35,包含了河北地區(qū)流行的大部分菌株型別。21株tcd A-tcd B+型艱難梭菌主要為ST37型(20/21),另外還有1株為ST81型,而ST81是ST37的單位點變異型(SLV)。此外本研究首次發(fā)現(xiàn)2個新ST型(成功注冊Griffiths監(jiān)管的國際艱難梭菌MLST數(shù)據(jù)庫),分別為ST348(等位基因譜1-1-2-3-1-5-3)1株,ST349(等位基因譜1-1-7-1-5-3-1)1株。2與其他ST型艱難梭菌相比,ST37型艱難梭菌對左氧氟沙星、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、頭孢曲松、利福昔明和美羅培南的耐藥率更高(P均0.05)。各ST型艱難梭菌對環(huán)丙沙星的耐藥率沒有統(tǒng)計學(xué)差異,各ST型艱難梭菌對頭孢他啶均耐藥,對甲硝唑、萬古霉素和非達(dá)霉素均敏感。3將ST37型艱難梭菌的蛋白質(zhì)量圖譜與其他ST型艱難梭菌的蛋白質(zhì)量圖譜進行對比發(fā)現(xiàn),ST37型艱難梭菌的蛋白質(zhì)量圖譜中有一組特異性的蛋白峰m/z 3240和m/z 3285。通過檢測這組特征峰可以達(dá)到快速鑒定ST37型的目的,該方法鑒定ST37型的特異度為99%,靈敏度為95%,陽性預(yù)測值為95%,陰性預(yù)測值為99%。Microflex LT和VITEK MS兩種型號的質(zhì)譜儀得到了相同的結(jié)果。重復(fù)性實驗結(jié)果:27張ST37型菌株圖譜均存在m/z 3240和m/z 3285峰,27張非ST37型菌株圖譜均不存在m/z3240和m/z 3285峰,m/z 3240和m/z 3285峰在ST37型菌株中有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。并且,從不同國家和地區(qū)收集的38株艱難梭菌(包括22株ST37型和16株非ST37型艱難梭菌)對快速鑒定方法進行驗證,其中21株(95.5%)ST37型艱難梭菌被成功鑒定出。結(jié)論:1與其他型別相比,ST37型艱難梭菌耐藥形勢嚴(yán)峻,應(yīng)警惕抗生素選擇壓力下,ST37型在醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行。2 ST37型艱難梭菌的MALDI-TOF質(zhì)譜中存在兩個特征性蛋白峰m/z 3240和m/z 3285,可以作為ST37型艱難梭菌的生物標(biāo)志物。3首次建立的基于MALDI-TOF MS的ST37型艱難梭菌快速鑒定技術(shù)具有簡單、快速、高通量、低成本的特點,適用于CDI的防治和監(jiān)控工作。
[Abstract]:Objective : Clostridium difficile ( CD ) is a special anaerobic and Gram - positive bacillus , which is the main pathogenic bacterium causing antibiotic - related diarrhea and nosocomial infection . The main pathogenic mechanism of Clostridium difficile is related to the two toxins produced by the bacterium , toxin A ( Tcd A ) and cytotoxin B ( Tcd B ) . This study has established a method for rapid detection of C . difficile infection by MALDI - TOF MS . The results showed that 104 strains were tcd A + tcd B + cdt A - cdt B - , 4 strains were tcd A + tcd B + cdt A + cdt B + , 21 strains were tcd A - cdt B + cdt A - cdt B + cdt A + cdt A - cdt B - , 30 strains were non - producing strain tcd A - tcd B - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt B - , 30 strains were non - producing strain tcd A - tcd B - cdt A - cdt B - . The results showed that there were two characteristic protein peaks m / z 3240 and m / z 3285 in 27 strains of ST37 type . The results showed that there were two characteristic protein peaks m / z 3240 and m / z 3285 in 27 strains of ST37 type .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 WANG Ye Ru;CHEN Qian;CUI Sheng Hui;LI Feng Qin;;Characterization of Staphylococcus aureus Isolated from Clinical Specimens by Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry[J];Biomedical and Environmental Sciences;2013年06期

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本文編號：1363198