本文關(guān)鍵詞：人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶同工酶1單克隆抗體的篩選鑒定及膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備

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【摘要】：目的:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)被廣泛認(rèn)為是肝損傷和臨床前藥物毒性研究最敏感的標(biāo)志物,臨床主要通過(guò)測(cè)定其總活性來(lái)判斷是否有肝損傷。對(duì)ALT的兩種同工酶,ALT1和ALT2的特異性檢測(cè)較ALT總活性測(cè)定具有更高的診斷價(jià)值。本研究主要通過(guò)基因重組技術(shù)獲得ALT1同工酶重組蛋白,并采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備出具有高度特異性和靈敏度的ALT1同工酶單抗,然后通過(guò)抗體的配對(duì)篩選獲得能夠特異性檢測(cè)ALT1的最佳配對(duì)單克隆抗體。以篩選出的單抗為基礎(chǔ),制備出ALT1膠體金免疫層析試紙條,為特異性檢測(cè)血清中ALT1蛋白提供了有力的依據(jù),同時(shí)也有利于初步探討人血清中ALT1分布水平與ALT活性的關(guān)系。方法:利用RT-PCR方法從人肝癌細(xì)胞(HepG2)擴(kuò)增回收完整的ALT1基因,采用基因重組技術(shù)與pET32a(+)質(zhì)粒連接,獲得含有ALT1完整基因的重組質(zhì)粒。并將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET32a(+)-ALT1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá),采用鎳柱(Ni2+)親和層析法純化ALT1重組蛋白。用純化后的蛋白免疫Balb/c小鼠,并將經(jīng)過(guò)四次免疫后的小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和有限稀釋法進(jìn)行克隆篩選,至挑選出單一并且能夠穩(wěn)定分泌特異性MAb的雜交瘤細(xì)胞株。采用雙抗體夾心ELISA法篩選出一對(duì)特異性的單抗,用于制備膠體金免疫層析試紙條。對(duì)試紙條的靈敏度和特異性進(jìn)行分析后,檢測(cè)不同ALT活性的人血清樣本。結(jié)果:通過(guò)原核表達(dá)制備出了ALT1重組蛋白。以純化后的ALT1作為抗原免疫Balb/c小鼠,并且采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù),獲得了8株單一且能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。并采用雙抗體夾心ELISA法篩選出BD7和DG3配對(duì)的MAb,經(jīng)過(guò)驗(yàn)證這對(duì)單克隆抗體具有高度的特異性、抗體效價(jià)及親和力。并且根據(jù)篩選出的單克隆抗體BD7和DG3,制備出了具有高度靈敏度和特異性的ALT1膠體金快速檢測(cè)試紙條。試紙條能夠檢測(cè)的最低ALT1活性為12U/L,且特異性高與其他蛋白沒(méi)有交叉反應(yīng)。結(jié)論:以原核表達(dá)出的ALT1重組蛋白為基礎(chǔ),通過(guò)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)以及抗體配對(duì)篩選,獲得了2株具有高度特異性、抗體效價(jià)及親和力的單克隆抗體BD7和DG3,并成功制備出具有高度靈敏度和特異性的ALT1膠體金免疫層析試紙條,為特異性檢測(cè)血清中ALT1蛋白提供了有力的依據(jù),為進(jìn)一步探討ALT1同工酶的分布水平與ALT活性關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R446.6

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

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本文編號(hào)：1250130