本文關(guān)鍵詞：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及免疫抑制作用比較

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【摘要】：研究背景異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hemotoic stem cell transplantation, allo-HSCT)是治療各種血液系統(tǒng)惡性腫瘤、重型再生障礙性貧血及重癥地中海貧血等的有效治療方法,但移植相關(guān)并發(fā)癥仍是威脅患者生命的重要因素,其中移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)是移植后最嚴(yán)重最棘手的并發(fā)癥之一,急性移植物抗宿主病(aGVHD)是移植后患者非復(fù)發(fā)死亡的主要原因,其發(fā)生必須具備三個前提：①移植物中含有足夠數(shù)量的識別和攻擊宿主異源性抗原的免疫活性細(xì)胞；②宿主應(yīng)有與移植物不同的同種異體抗原；③宿主處于免疫無能狀態(tài),對移植物不產(chǎn)生排斥。目前根據(jù)GVHD發(fā)病機(jī)制的不同,各種抗GVHD的化學(xué)藥物在臨床上廣泛應(yīng)用,如人抗胸腺球蛋白(anti-human thymocyte globulin, ATG)、抗TNF抗體英夫利昔、環(huán)孢素A(CsA)、他克莫司(FK506)等,但這些非特異性免疫抑制藥物本身具有毒副作用且易導(dǎo)致病毒及真菌等感染,從而影響療效。如何降低allo-HSCT患者移植相關(guān)死亡率、提高患者生存率及生存質(zhì)量,是目前臨床工作面臨的挑戰(zhàn)。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)作為中胚層來源的具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞,MSC在體外可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種組織細(xì)胞,其經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)、凍存復(fù)蘇后仍具有多向分化潛能。且MSC具有造血支持、低免疫原性、免疫抑制及無致瘤性等特點,近年來,隨著細(xì)胞替代治療與組織工程學(xué)的不斷發(fā)展,MSC已被應(yīng)用于自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、阿爾茲海默病、心血管疾病等多種疾病的治療研究,在血液學(xué)方面,已被應(yīng)用于GVHD的預(yù)防和治療。目前骨髓仍是MSC的主要來源,在血液系統(tǒng)疾病方面,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cell,hBMSC)已被應(yīng)用于臨床治療GVHD,但成人hBMSC細(xì)胞數(shù)量極少,并且增殖分化潛能隨年齡的增大而下降,病毒感染率較高,供者h(yuǎn)BMSC的采集須行有創(chuàng)性骨髓穿刺,亦使其來源受到限制。引起aGVHD發(fā)生、發(fā)展的主要細(xì)胞為免疫活性細(xì)胞,即供者來源的成熟T淋巴細(xì)胞在患者體內(nèi)的活化,可引起其一系列的反應(yīng),繼而激活并產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12及其受體等。其中IL-2和IFN-γ為Th1細(xì)胞因子,Thl細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,在遲發(fā)型超敏反應(yīng)、部分自身免疫性疾病、宿主體內(nèi)抗胞內(nèi)病原感染都起著重要作用,Th1細(xì)胞與aGVHD的發(fā)生發(fā)展也有密切關(guān)系。而我們知道,hAMSC具有免疫抑制作用,而且其低表達(dá)HLA-ABC和HLA-G,不表達(dá)HLA-DR表面抗原,表現(xiàn)出低免疫源性和免疫抑制作用,且移植到動物體內(nèi)無致瘤性,是較為理想的免疫赦免細(xì)胞,為各種疾病的細(xì)胞治療提供了新的選擇。在異基因造血干細(xì)胞移植中,如何平衡機(jī)體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞及Ⅰ/Ⅱ型細(xì)胞因子,對于預(yù)防和治療GVHD具有重要意義。由此可見,人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可能為GVHD治療新的種子細(xì)胞,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。已有研究報道間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎存在于所有的組織器官中,且不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,其體外擴(kuò)增的能力也不完全相同。已有研究報道了臍帶及胎肺來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比,前者的體外擴(kuò)增能力明顯強(qiáng)于后者,前者可在傳代40多次后仍保持原有的生物學(xué)特性及增殖能力。因此,目前越來越多的研究組致力于尋找新的間充質(zhì)干細(xì)胞,希望能夠替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床中的應(yīng)用,以解決骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源不足的問題。2004年研究者首次從人羊膜分離出間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)其從羊膜中胚層分化而來,具有向三胚層分化的多潛能性,人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(humanamniotic mesenchymal stem cells, hAMSC)從健康產(chǎn)婦正常分娩后廢棄的胎盤組織中分離培養(yǎng),羊膜組織來源充足,系產(chǎn)后廢棄物、不受倫理學(xué)限制,且羊膜不含有血管、神經(jīng)、肌肉等組織,分離提純過程相對簡單、分離細(xì)胞純度較高。經(jīng)免疫表型鑒定,hAMSC不僅表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原,還表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)表面抗原,如Oct-3、Oct-4、SSEA-3、SSEA-4等,這提示hAMSC可能還具有干細(xì)胞特性。近年來,人羊膜干細(xì)胞已經(jīng)在角膜修復(fù)、燒傷性疾病、骨科疾病、脊髓損傷等相關(guān)疾病的臨床研究和治療取得療效。那么,hAMSC與hBMSC生物學(xué)特性相似,均具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性,且hAMSC可能還具有干細(xì)胞特性,細(xì)胞來源更豐富,是否可成為hBMSC的替代治療用于GVHD的預(yù)防和治療呢?研究目的本實驗通過對hAMSC和hBMSC生物學(xué)特性及對異體外周血淋巴細(xì)胞的免疫抑制功能的比較,希望為hAMSC治療GVHD、解決hBMSC來源不足的問題提供實驗依據(jù)。研究方法通過酶消化法從健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn)的新鮮胎盤羊膜中分離培養(yǎng)hAMSC,通過密度梯度離心法從健康供者志愿捐獻(xiàn)的骨髓中分離培養(yǎng)hBMSC。實驗分為兩部分：第一部分實驗為hAMSC與hBMSC生物學(xué)特性的比較,分別培養(yǎng)相同傳代代數(shù)的人羊膜來源與骨髓來源的MSC,對二者進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,通過CCK-8法檢測兩種細(xì)胞的增殖情況并生長曲線繪制,對兩種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測,采用流式免疫分型技術(shù)分別對兩種細(xì)胞進(jìn)行免疫表型鑒定,采用免疫熒光技術(shù)檢測兩種細(xì)胞的波形蛋白(vimentin);第二部分實驗為hAMSC和hBMSC對異體外周血淋巴細(xì)胞的免疫抑制功能的比較,經(jīng)絲裂霉素處理后的hAMSC與hBMSC分別與植物血凝集素(phytohemagglutinin, PHA)刺激的異體人淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),分別建立MSC與異體人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)共培養(yǎng)體系,采用CCK-8法比較兩種不同共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞的增殖情況,采用ELISA法比較兩種不同共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)的分泌水平。研究結(jié)果(1)hAMSC與hBMSC細(xì)胞形態(tài)相似,hAMSC可傳至15代以上,hBMSC傳至第6-7代細(xì)胞后,開始老化、生長增殖能力明顯減弱；(2)在細(xì)胞周期的比較中,hAMSC與hBMSC二者的G2/M期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；(3)細(xì)胞免疫表型鑒定,hAMSC和hBMSC細(xì)胞表面均表達(dá)CD105、CD90、 CD73,均不表達(dá)CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR,hAMSC表達(dá)Oct-3/4,而hBMSC不表達(dá)Oct-3/4；(4)免疫熒光檢測結(jié)果顯示,hAMSC與hBMSC均表達(dá)vimentin;(5) hAMSC和hBMSC均對PHA刺激的PBMC增殖具有抑制作用,且隨著hAMSC和hBMSC細(xì)胞比例的增高,抑制能力增強(qiáng),二者無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；(6) ELISA結(jié)果提示,hAMSC+PBMC+PHA共培養(yǎng)組上清中IFN-y水平較hBMSC+PHA+PBMC組低(P=0.056),而hAMSC+PBMC+PHA共培養(yǎng)組及hBMSC+PHA+PBMC共培養(yǎng)組分別與PBMC+PHA組上清比較,IFN-y水平明顯降低(P0.05)。結(jié)論hAMSC比hBMSC具有更強(qiáng)的增殖能力和干細(xì)胞特性,二者均有免疫抑制功能,hAMSC與hBMSC在體外均能抑制PHA刺激的異體淋巴細(xì)胞增殖并減少其IFN-γ的分泌。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R457.7

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本文編號：1216367