本文關鍵詞：類手槍脫氧核酶在糖傳感器中的設計應用

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【摘要】：上世紀80年代初,Cech和Altman等分別在內含子和RNase P中發(fā)現了具有催化功能的RNA分子,稱為核酶(RNAzyme,ribozyme)。核酶的發(fā)現改變了“酶即蛋白質”這一傳統學術觀念,繼而引發(fā)了對DNA催化功能的研究。1994年,Breaker和Joyce首次報道了一種Pb2+依賴且具有斷裂RNA活性的DNA分子,其反應動力學遵循米氏方程,這類具有特異性催化功能DNA稱之為脫氧核酶(DNAzyme,deoxyribozyme)。迄今為止,生物體內天然存在的脫氧核酶尚未被發(fā)現,所有催化類型脫氧核酶都是通過體外進化篩選獲得,其中具有斷裂活性脫氧核酶占多數,例如類手槍脫氧核酶(pistol-like DNAzyme,PLDz)。該脫氧核酶是Breaker實驗室以“Cu2+/維生素C”為輔因子通過體外進化篩選獲得的一種具有自身斷裂活性的單鏈DNA分子,其催化機制被認為是自由基介導的DNA氧化斷裂反應。在Breaker等人的研究基礎上,我們對類手槍脫氧核酶的酶學性質、構效關系以及催化機制等方面進行了較為深入研究。本論文將重點介紹該脫氧核酶在葡萄糖和蔗糖傳感器方面的應用研究。根據類手槍脫氧核酶催化活性與輔因子之間關系,我們設計了一種雙酶偶聯型葡萄糖傳感器GOx-PLDz 1.0,其檢測原理為:樣品中β-D-葡萄糖作為一級信號分子被葡萄糖氧化酶識別并將其催化生成葡萄糖酸和H2O2,H2O2作為二級信號分子被類手槍脫氧核酶識別,在H2O2和二價金屬離子存在下,該脫氧核酶發(fā)生自身斷裂反應,斷裂程度與溶液中葡萄糖濃度關系符合“Double Boltzmann”方程。GOx-PLDz 1.0傳感器葡萄糖檢測下限5μM,利用該傳感器對淚液和唾液中葡萄糖含量進行了檢測,其含量分別為720±81和405±56μM,實現了非創(chuàng)傷方式檢測體內葡萄糖含量。在GOx-PLDz 1.0設計基礎上,我們引入反式結構類手槍脫氧核酶構建GOx-PLDz 1.1,表明反式結構類手槍脫氧核酶可以作為新一代葡萄糖傳感器元件。為提高葡萄糖傳感器實用性和操作性,我們在GOx-PLDz 1.0和1.1基礎上發(fā)展出一種高靈敏熒光型葡萄糖傳感器GOx-PLDz 2.0。GOx-PLDz 2.0的檢測原理與GOx-PLDz 1.0和1.1的檢測原理相同,最大的區(qū)別之處在于信號輸出部分,我們在類手槍脫氧核酶與底物化學修飾熒光/淬滅分子,當葡萄糖存在時,GOxPLDz 2.0發(fā)射熒光信號,可大幅提高傳感器檢測靈敏度。熒光信號強度與葡萄糖濃度之間關系符合“Extreme”方程,葡萄糖濃度檢測下限為50 nM。利用GOxPLDz 2.0傳感器,我們對10個唾液樣品進行檢測分析。在類手槍脫氧核酶構效關系研究中,我們發(fā)現了一個活性增強的突變體PLDz-T3G。我們將蔗糖酶、葡萄糖氧化酶以及類手槍脫氧核酶突變體(PLDz-T3G)組合,在葡萄糖傳感器GOx-PLDz 1.0基礎上設計了三酶偶聯型蔗糖傳感器IGP1.0,其蔗糖檢測下限為5μM。葡萄糖氧化酶預處理后,IGP 1.0傳感器表現出較強的抗干擾性。利用該傳感器我們對8種飲料中蔗糖濃度進行檢測,發(fā)現可口可樂零度含有痕量蔗糖,可口可樂、百事可樂以及紅牛中蔗糖含量在配料表標注的范圍內,而以綠茶為代表的茶飲料中則由于含有維生素C干擾蔗糖檢測�；陬愂謽屆撗鹾嗣�,我們成功設計了葡萄糖傳感器GOx-PLDz 1.0、1.1和2.0以及蔗糖傳感器IGP 1.0,這些傳感器表明脫氧核酶在糖生物傳感器中具有較廣闊的應用前景。以此為基礎,整合其他功能性材料,如金納米顆粒、碳納米管以及石墨烯等,未來可以研究開發(fā)出“超靈敏”、“可視化”葡萄糖和蔗糖傳感器,前者服務于廣大糖尿病患者及易感人群日常體內葡萄糖濃度檢測,后者應用在生物體內蔗糖代謝研究。
【關鍵詞】：類手槍脫氧核酶 葡萄糖氧化酶 蔗糖酶 葡萄糖傳感器 蔗糖傳感器
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TP212.3;Q55
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-24
• 1.1 葡萄糖傳感器的研究進展11-14
• 1.1.1 電化學葡萄糖傳感器11-12
• 1.1.2 化學發(fā)光型葡萄糖傳感器12-13
• 1.1.3 比色型葡萄糖傳感器13
• 1.1.4 熒光型葡萄糖傳感器13-14
• 1.2 蔗糖傳感器的研究進展14-15
• 1.3 脫氧核酶概述15-24
• 1.3.1 脫氧核酶與輔因子關系16-19
• 1.3.2 脫氧核酶在基因沉默方面的應用19
• 1.3.3 基于脫氧核酶設計構建DNA分子裝置19
• 1.3.4 基于脫氧核酶設計構建傳感器19-24
• 第2章 實驗材料、設備及方法24-31
• 2.1 實驗儀器24-25
• 2.2 試劑和溶液配制25-26
• 2.3 其他實驗材料26-27
• 2.4 實驗方法27-31
• 2.4.1 葡萄糖檢測27
• 2.4.2 葡萄糖傳感器擬合方程27-28
• 2.4.3 實際樣品中的葡萄糖檢測28-29
• 2.4.4 蔗糖檢測29
• 2.4.5 蔗糖傳感器擬合方程29-30
• 2.4.6 抗干擾樣品處理30-31
• 第3章 基于類手槍脫氧核酶設計構建葡萄糖傳感器31-52
• 3.1 葡萄糖傳感器GOx-PLDz 1.0 研究31-42
• 3.1.1 葡萄糖傳感器GOx-PLDz 1.0 設計與檢測原理31-32
• 3.1.2 外加H2O2模擬測定葡萄糖32-34
• 3.1.3 金屬離子對傳感器GOx-PLDz 1.0 影響34-37
• 3.1.4 GOx-PLDz 1.0 傳感器檢測條件優(yōu)化37-39
• 3.1.5 GOx-PLDz 1.0 傳感器靈敏度和專一性鑒定39-40
• 3.1.6 測定淚液、唾液中葡萄糖含量40-42
• 3.2 葡萄糖傳感器GOx-PLDz 1.1 研究42-43
• 3.3 葡萄糖傳感器GOx-PLDz 2.0 研究43-48
• 3.3.1 GOx-PLDz 2.0 葡萄糖傳感器設計與檢測原理43-44
• 3.3.2 熒光與淬滅分子選擇44-45
• 3.3.3 GOx-PLDz 2.0 葡萄糖傳感器檢測條件優(yōu)化45-46
• 3.3.4 GOx-PLDz 2.0 葡萄糖傳感器靈敏度與專一性鑒定46-47
• 3.3.5 唾液樣品檢測47-48
• 3.4 葡萄糖傳感器研究討論48-50
• 3.4.1 GOx-PLDz 1.0 生物傳感器研究意義48-49
• 3.4.2 熒光型葡萄糖傳感器GOx-PLDz 2.049-50
• 3.4.3 GOx-PLDz 2.0 葡萄糖傳感器改進與發(fā)展50
• 3.5 葡萄糖傳感器研究結論50-52
• 第4章 基于類手槍脫氧核酶設計構建蔗糖傳感器52-62
• 4.1 蔗糖傳感器IGP 1.0 研究52-61
• 4.1.1 蔗糖傳感器IGP 1.0 設計與檢測原理52-53
• 4.1.2 類手槍脫氧核酶與突變體T3G活性比較53-54
• 4.1.3 蔗糖傳感器IGP 1.0 檢測條件優(yōu)化54-56
• 4.1.4 蔗糖傳感器IGP 1.0 靈敏度、專一性以及抗干擾性56-59
• 4.1.5 飲料樣品檢測59-61
• 4.2 蔗糖傳感器IGP 1.0 研究討論61
• 4.3 蔗糖傳感器IGP 1.0 研究結論61-62
• 參考文獻62-67
• 研究生期間發(fā)表的文章67-68
• 致謝68

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1 潘光錦,韓金祥;脫氧核酶的研究進展[J];生物工程進展;2001年05期

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5 李娜;朱道銀;;10-23脫氧核酶及其應用進展[J];醫(yī)學綜述;2006年02期

6 王愛民;周國燕;;10-23脫氧核酶的研究進展[J];中國生物制品學雜志;2011年03期

7 王同慧;凌保東;;脫氧核酶在細菌研究領域的現狀與展望[J];中國抗生素雜志;2013年07期

8 楊玉成;洪蘇玲;;脫氧核酶及其基因治療應用進展[J];重慶醫(yī)學;2006年23期

9 廉國利;楊錫強;俞海國;趙曉東;;脫氧核酶在小鼠體內抗呼吸道合胞病毒的效應[J];陜西醫(yī)學雜志;2007年07期

10 楊中漢,馮建生;脫氧核酶:生物催化劑的新成員[J];生命的化學;2000年02期

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1 孫侖泉;;新型基因抑制工具:脫氧核酶的發(fā)現與應用[A];中國病理生理學會受體、腫瘤和免疫專業(yè)委員會聯合學術會議論文匯編[C];2010年

2 周娟;楊錫強;蔣利萍;王莉佳;崔玉霞;;特異性脫氧核酶抗呼吸道合胞病毒感染的體內研究[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術會議論文匯編[C];2006年

3 姜大志;盛永杰;張今;;關鍵殘基嫁接實現錘頭核酶轉換脫氧核酶[A];第九屆全國酶學學術討論會暨鄒承魯誕辰85周年紀念會論文摘要集[C];2008年

4 劉彬;王雪麗;張華利;張今;李正強;;一種在生理條件下簡便、快速的測定脫氧核酶切割RNA反應的動力學參數的方法[A];第七屆全國酶學學術討論會論文摘要集[C];2004年

5 溫曉玉;�？∑�;王峰;田梅梅;;丙型肝炎病毒特異性脫氧核酶體外切割活性的初步研究[A];中華醫(yī)學會第十二次全國病毒性肝炎及肝病學術會議論文匯編[C];2005年

6 蔣利萍;方平;王莉佳;;脫氧核酶抑制突變型p53基因表達的體外研究[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術會議論文匯編[C];2006年

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8 于倩;劉奇峰;劉閨男;;早期生長反應因子-1特異脫氧核酶對大鼠血管平滑肌細胞基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶組織抑制劑-2表達的影響[A];中華醫(yī)學會第11次心血管病學術會議論文摘要集[C];2009年

9 裴仁軍;;基于脫氧核酶的生物網絡模塊的研究[A];中國化學會第28屆學術年會第4分會場摘要集[C];2012年

10 牛淑妍;姜禹;張書圣;;基于17E脫氧核酶特異性熒光檢測Pb~(2+)[A];第十屆中國化學會分析化學年會暨第十屆全國原子光譜學術會議論文摘要集[C];2009年

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1 趙長安;脫氧核酶抗呼吸道合胞病毒效應的體外研究[D];重慶醫(yī)科大學;2002年

2 姜大志;關鍵殘基嫁接產生新型脫氧核酶[D];吉林大學;2008年

3 廉國利;脫氧核酶在小鼠體內抗呼吸道合胞病毒的效應[D];重慶醫(yī)科大學;2003年

4 劉彬;基于莖—環(huán)結構構建精確識別和切割底物的脫氧核酶[D];吉林大學;2007年

5 于樂成;脫氧核酶抗丙型肝炎病毒活性的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2003年

6 張迪;基于10-23脫氧核酶催化結構域的新型化學修飾策略與高效脫氧核酶的發(fā)現及催化機制研究[D];沈陽藥科大學;2010年

7 周娟;廣譜脫氧核酶抗不同免疫功能小鼠呼吸道合胞病毒感染的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2006年

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7 許家翠;通過合理設計獲得新型脫氧核酶—錘頭脫氧核酶[D];吉林大學;2006年

8 王琦;10-23脫氧核酶嘌呤堿基的結構修飾與活性評價[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2011年

9 陳燕;新型納米羥基磷灰石—脫氧核酶遞送系統的應用研究[D];中南大學;2013年

10 李慧;脫氧核酶抑制甲型流感病毒復制的體外研究[D];重慶醫(yī)科大學;2006年

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