發(fā)布時(shí)間：2022-01-15 10:22

　　近年來,利用生物傳感器對(duì)誘變菌株進(jìn)行高通量篩選成為了獲得高產(chǎn)菌株的一種有效方式。論文以鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum）SYPA5-5為基礎(chǔ),構(gòu)建了生物傳感器ARG-ON（ARG-sacB和ARG-gfp）。通過對(duì)含有該生物傳感器的鈍齒棒桿菌菌株進(jìn)行誘變,然后利用該生物傳感器對(duì)誘變菌株進(jìn)行高通量篩選,最終獲得了精氨酸高產(chǎn)誘變菌株,提高了菌株的精氨酸產(chǎn)量。主要研究結(jié)果如下:（1）分別以sacB和gfp基因?yàn)閳?bào)告基因,構(gòu)建了生物傳感器ARG-ON（ARG-sacB和ARG-gfp）。將啟動(dòng)子PargC分別與基因sacB和gfp進(jìn)行串聯(lián),然后連接到載體pDXW-10中,構(gòu)建出重組質(zhì)粒PC-sacB-10和PC-gfp-10。隨后將argR基因連接到重組質(zhì)粒中,從而構(gòu)建出生物傳感器ARG-ON（ARG-sacB和ARG-gfp）。（2）驗(yàn)證在生物傳感器ARG-ON（ARG-sacB和ARG-gfp）中,菌株的熒光強(qiáng)度和細(xì)胞生長(zhǎng)狀況與精氨酸產(chǎn)量之間的關(guān)系。分別在培養(yǎng)基中加入0,20,40,60,80,100 mmol·L-1的精氨酸,然后對(duì)含有生物傳感器ARG-sac... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

生物傳感器原理示意圖

毒代謝中間產(chǎn)物的毒害作用，平衡代謝流，顯著減弱細(xì)胞異源代謝途徑的不適應(yīng)性[3]。Zhang[23]等在大腸桿菌中利用轉(zhuǎn)錄因子FadR構(gòu)建了能夠響應(yīng)脂肪酸的生物傳感器，從而協(xié)調(diào)脂肪酸代謝通路中�；鵆oA和乙醇的生物合成。在�；鵆oA積累后，阻遏物FadR與其靶啟動(dòng)子解離，使乙醇的生物合成得到激活。在臘酯合酶的作用下，乙醇和�；鵆oA結(jié)合轉(zhuǎn)化為脂肪酸乙酯（FAEE）。通過生物傳感器FadR的構(gòu)建，成功抑制了乙醇和脂酰CoA代謝前體物質(zhì)對(duì)于生長(zhǎng)的毒害作用和抑制作用，避免了乙醇的過量積累，平衡了代謝流，維持了細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)。圖1-2生物傳感器的分類和應(yīng)用Fig.1-2Classificationandapplicationofthebiosensor（A）生物傳感器的分類（B）生物傳感器的應(yīng)用

第一章緒論7作用、過表達(dá)精氨酸操縱子、優(yōu)化磷酸戊糖途徑的NADPH供應(yīng)、減少副產(chǎn)物的形成、增加精氨酸合成途徑的碳通量、增加葡萄糖的消耗量等一系列代謝工程技術(shù)，最終構(gòu)建了一株精氨酸高產(chǎn)菌株，5L發(fā)酵罐產(chǎn)量可達(dá)87.3g·L-1。2017年，Guo[53]等在鈍齒棒桿菌SDNN403中提高了氮供應(yīng)和氨同化水平，通過在發(fā)酵過程中添加氮原子供體（L-谷氨酸、L-天冬氨酸），并過表達(dá)其中的glnA、aspA和gdh基因，最終菌株的5L發(fā)酵罐產(chǎn)量為53.2g·L-1，較其出發(fā)菌株提高了41.5%。2019年，闞寶軍，董晉軍[54]等在谷氨酸棒狀桿菌SNK118中表達(dá)了3-磷酸甘油醛脫氫酶，該酶為NADP+依賴型，最終使得細(xì)胞內(nèi)的NADPH水平得到了提高，搖瓶發(fā)酵可產(chǎn)L-精氨酸11.6g·L-1。圖1-3鈍齒棒桿菌中L-精氨酸合成代謝工程改造示意圖[39]Fig.1-3MethodsofmetabolicengineeringforL-argininesynthesisinC.crenatum[39]1.5報(bào)告基因研究概述1.5.1綠色熒光蛋白gfp綠色熒光蛋白gfp（greenfluorescentprotein）是1962年由Shimomure[55]等在多管水母中發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)其被藍(lán)光或紫外光激發(fā)后，能夠發(fā)出綠色熒光。1994年，Chalfie[56]等首次在大腸桿菌中表達(dá)了綠色熒光蛋白，使得之后gfp被更加廣泛地研究和應(yīng)用。綠色熒光蛋白gfp在多種生物體內(nèi)均能夠成功表達(dá)并發(fā)出熒光，在與靶基因融合后，它不會(huì)影響靶基因的功能，而且其熒光的表達(dá)不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒性[57]。此外，綠色熒光蛋白gfp的檢測(cè)方法十分簡(jiǎn)單方便，利用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀等儀器均能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行檢測(cè)�；谶@些優(yōu)點(diǎn)，綠色熒光蛋白gfp成為了一直以來用于反映細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平及對(duì)蛋白進(jìn)行

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[5]L-精氨酸生物合成機(jī)制及其代謝工程育種研究進(jìn)展[J]. 程功,徐建中,張偉國(guó).  微生物學(xué)通報(bào). 2016(06)
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[9]用綠色熒光蛋白（GFP）作為報(bào)告分子篩選有效的siRNA[J]. 單志新,林秋雄,符永恒,鄧春玉,李曉紅,余細(xì)勇.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2007(03)
[10]L-精氨酸高產(chǎn)菌的選育及基于代謝流量分布的育種機(jī)制[J]. 許正宏,熊筱晶,竇文芳,陶文沂.  工業(yè)微生物. 2006(04)

碩士論文
[1]構(gòu)建表達(dá)蓖麻毒素A鏈與綠色熒光蛋白融合基因研究蓖麻毒素A鏈的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[D]. 劉瓊.浙江大學(xué) 2006



本文編號(hào)：3590451