畢赤酵母丙二酰輔酶A生物傳感器構建及代謝動態(tài)控制應用
發(fā)布時間：2020-12-09 22:07
代謝工程改造已成為提高微生物天然生產及異源合成各種高附加值產物產量與得率的常用技術手段。傳統(tǒng)代謝工程技術多采用靜態(tài)控制策略,主要為合成途徑限速酶的過表達、競爭途徑的敲除/低、ATP供應的優(yōu)化控制、氧化還原反應的平衡及前體代謝的調控等,以此重新分配穩(wěn)態(tài)通路的通量。但是,這種工程菌株往往不能對基因表達進行動態(tài)響應及調控,適應環(huán)境變化的魯棒性低。動態(tài)控制策略可以使細胞持續(xù)感應培養(yǎng)體系的環(huán)境變化,重新平衡核心代謝途徑的通量,調控生理狀態(tài)及代謝特征。因此,動態(tài)控制可以更好地平衡菌株生長、代謝與目標產物合成,減少有毒中間體的積累,而且異源途徑酶表達的動態(tài)控制可以有效地降低外源多酶共表達的代謝壓力。近年來,啟動子文庫的高通量篩選及合成生物學技術的快速發(fā)展,為動態(tài)控制策略的實現提供了重要支持,但目前有關動態(tài)控制策略的報道多集中于原核細胞,酵母及高等真核細胞的工作則很少,這主要與真核細胞復雜的轉錄調控機制有關。丙二酰輔酶A（Mal-CoA）是聚酮、黃酮、脂肪酸等活性分子生物合成的重要前體,也是參與細胞生理反應的關鍵代謝分子。通常情況下,細胞內Mal-CoA濃度很低,提取定量后進行代謝調控存在諸多困難,在...
【文章來源】：華東理工大學上海市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數】：112 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
圖１．１酵母Ａｃｃｌ保守功能域??Ｆｉｇ．?１．１?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?ｄｏｍａｉｎ?ｏｆ?Ａｃｃｌ?ｉｎ?ｙｅａｓｔ．??１．２．３丙二酰輔酶Ａ衍生化合物??
高附加值Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生??化合物，更是引起了研宄人員的廣泛興趣。Ｍａｒｘ等ｆ３５］報道了通過用強組成型啟動子Ｐｍｐ??取代天然啟動子在酵母中異源高效合成核黃素的途徑。使用具有三個啟動子表達的??途徑基因的工程化酵母，用于生產生物柴油，也取得了進展％。本實驗室高麗梅碩士??（６－ＭＳＡ）［３７］、劉一奇博士（洛伐他汀和莫納可林乃網、薛莖碩士（梧霉素）岡、孔垂杏碩??士（土曲霉酸）等，己成功實現各類聚酮化合物在畢赤酵母中的異源合成。??各類Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生化合物在細胞內的合成途徑如圖１．２所示。整個代謝途徑的限速??步驟在于Ｍａｌ－ＣｏＡ。由于Ｍａｌ－ＣｏＡ與細胞生長以及磷脂和脂肪酸的合成直接相關，細??胞內濃度受到嚴格調節(jié)，維持在非常低的水平，難以定量調控，可用性被限制，影響了??一系列下游化合物的合成。隨著在生物合成級聯反應中引入新基因，對細菌進行工程改??造，在細胞生長所需的Ｍａｌ－ＣｏＡ和產物合成之間實現新陳代謝的平衡，是至關重要的。??細胞內Ｍａｌ－ＣｏＡ的有效利用，仍然是生產聚酮化合物和黃酮等的最大障礙之一。對不??同碳源而言，葡萄糖廉價且安全，但對于Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生物合成而言，葡萄糖在細胞內??代謝為Ｍａｌ－ＣｏＡ代謝步驟多，分支繁雜。乙醇作為碳源，在細胞內經過乙醇－乙醛－乙酸??－乙酰輔酶Ａ四個步驟，即可生成Ｍａｌ－ＣｏＡｌ３８】。因此，乙醇作為一種碳源用于Ｍａｌ－ＣｏＡ??的合成，是很有潛力的。本課題所用畢赤酵母為非葡萄糖效應酵母，具有高效的乙醇同??化能力，可有效促進Ｍａｌ－ＣｏＡ的合成［３８］。??Ｇｌｕｃｏｓｅ??Ｐｙｒｕｖａｔｅ?????｜Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ?｜．?Ｂｊ０．ｐ０｜ｙ
ｔｏｒ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｂ?Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ?ｏｆ?ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ??Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?Ａｃｔｉｎｇ?ｏｎ?ｃｈｒｏｍａｔｉｎ??ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??＿?ＮＵＣ［ｔ＾〇ｍｅ?化??ｄ?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｅｓｃａｐｅ?ｃ?ＰＩＣ?ｆｏｒｍａｔｉｏｎ??ｉ＞?Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ?Ｐｏｌ?ＩＩ?＼?ＴＦｌ＾ｔ＾ＴＦＩＩＨ?Ｍｅｄｉａｔｏｒ??ｙ?＾ＪｃＶ?ＣＴＤ?ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ?Ｍ?＾?＿??ｐｌｃ??圖１．５?ＲＮＡ聚合酶ＩＩ介導的基因轉錄過程??Ｆｉｇ．?１．５?Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ?ｂｙ?ＲＮＡ?ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?ＩＩ［１２０ｌ??１．６本課題設計背景及原理??Ｍａｌ－ＣｏＡ是所有活細胞脂肪酸合成的重要中間體，也是革蘭氏陽性菌脂質平衡調節(jié)??過程中的全局調控因子。體外轉錄和結合研宄表明，Ｍａｌ－ＣｏＡ是枯草芽孢桿菌ＦａｐＲ的??直接特異性誘導劑。ＦａｐＲ是一種保守的轉錄抑制因子，調控參與細菌脂肪酸和磷脂合??成的多個基因的表達。序列分析表明，ＦａｐＲ像許多細菌抑制因子一樣，具有Ｎ端ＤＮＡ??結合域（ＤＢＤ），可與一段３４?ｂｐ的ＤＮＡ序列／印（９結合（Ａ?＝?０．１２?ｐｍｏｌ／Ｌ）；同時Ｃ端??的晶體結構揭示了?ＦａｐＲ是一種具有硫酯酶樣“熱狗”折疊的同源二聚體蛋白，其類似??于幾種己知的結合�；o酶Ａ底物的硫酯酶，可特異性結合Ｍａｌ－ＣｏＡ?（ＡＴｄ?＝?２．４?ｐｍｏｌ／Ｌ）。??Ｎ端和Ｃ端結構域通過一個ａ螺旋連接（圖１．６）。??ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ??ｄｏｍａｉｎ?Ｍａｌ－ＣｏＡ?ｂｉｎｄ
【參考文獻】：
博士論文
[1]基于甲醇/乙醇底物的洛伐他汀及莫納可林J異源生物合成[D]. 劉一奇.華東理工大學 2018
本文編號：2907555
【文章來源】：華東理工大學上海市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數】：112 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
圖１．１酵母Ａｃｃｌ保守功能域??Ｆｉｇ．?１．１?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?ｄｏｍａｉｎ?ｏｆ?Ａｃｃｌ?ｉｎ?ｙｅａｓｔ．??１．２．３丙二酰輔酶Ａ衍生化合物??
高附加值Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生??化合物，更是引起了研宄人員的廣泛興趣。Ｍａｒｘ等ｆ３５］報道了通過用強組成型啟動子Ｐｍｐ??取代天然啟動子在酵母中異源高效合成核黃素的途徑。使用具有三個啟動子表達的??途徑基因的工程化酵母，用于生產生物柴油，也取得了進展％。本實驗室高麗梅碩士??（６－ＭＳＡ）［３７］、劉一奇博士（洛伐他汀和莫納可林乃網、薛莖碩士（梧霉素）岡、孔垂杏碩??士（土曲霉酸）等，己成功實現各類聚酮化合物在畢赤酵母中的異源合成。??各類Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生化合物在細胞內的合成途徑如圖１．２所示。整個代謝途徑的限速??步驟在于Ｍａｌ－ＣｏＡ。由于Ｍａｌ－ＣｏＡ與細胞生長以及磷脂和脂肪酸的合成直接相關，細??胞內濃度受到嚴格調節(jié)，維持在非常低的水平，難以定量調控，可用性被限制，影響了??一系列下游化合物的合成。隨著在生物合成級聯反應中引入新基因，對細菌進行工程改??造，在細胞生長所需的Ｍａｌ－ＣｏＡ和產物合成之間實現新陳代謝的平衡，是至關重要的。??細胞內Ｍａｌ－ＣｏＡ的有效利用，仍然是生產聚酮化合物和黃酮等的最大障礙之一。對不??同碳源而言，葡萄糖廉價且安全，但對于Ｍａｌ－ＣｏＡ衍生物合成而言，葡萄糖在細胞內??代謝為Ｍａｌ－ＣｏＡ代謝步驟多，分支繁雜。乙醇作為碳源，在細胞內經過乙醇－乙醛－乙酸??－乙酰輔酶Ａ四個步驟，即可生成Ｍａｌ－ＣｏＡｌ３８】。因此，乙醇作為一種碳源用于Ｍａｌ－ＣｏＡ??的合成，是很有潛力的。本課題所用畢赤酵母為非葡萄糖效應酵母，具有高效的乙醇同??化能力，可有效促進Ｍａｌ－ＣｏＡ的合成［３８］。??Ｇｌｕｃｏｓｅ??Ｐｙｒｕｖａｔｅ?????｜Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ?｜．?Ｂｊ０．ｐ０｜ｙ
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【參考文獻】：
博士論文
[1]基于甲醇/乙醇底物的洛伐他汀及莫納可林J異源生物合成[D]. 劉一奇.華東理工大學 2018
本文編號：2907555
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