開發(fā)具有高靈敏度、高選擇性和可快速定量生物分子的生物傳感器對于疾病診斷和生物醫(yī)學(xué)研究具有極其重要的意義。然而傳統(tǒng)的生化分析方法通常具有操作費時、靈敏度低、特異性差等缺點。在某些情況下,例如疾病發(fā)生的早期,目標(biāo)生物分子的濃度常常太低而不能通過這些常規(guī)方法檢測,往往需要繁瑣的程序來提高檢測靈敏度。因此,迫切需要開發(fā)更加簡單和超靈敏的生化分析方法用于低濃度靶標(biāo)的定量檢測。單分子熒光檢測方法可以很好地滿足上述需求,在開發(fā)超靈敏生物傳感器中極具潛力,通過用適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)標(biāo)記靶標(biāo)生物分子,即可實現(xiàn)單分子水平上對靶生物分子進(jìn)行定量檢測。與傳統(tǒng)的熒光系綜檢測方法相比,基于單分子檢測的生化分析方法具有超高靈敏度、良好選擇性、快速分析時間和低樣品消耗等顯著優(yōu)點,被視為一種可快速且簡單地定量低濃度生物分子的理想方法。本論文基于單分子熒光檢測技術(shù),結(jié)合先進(jìn)的生化分析方法,開發(fā)了一系列具有良好性能的單分子熒光生物傳感器,并將其用于多種生物分子的定量分析,例如酶、核酸及活細(xì)胞等。具體研究內(nèi)容包括:(1)構(gòu)建了一種基于分子信標(biāo)功能化量子點的單分子熒光生物傳感器用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測。細(xì)胞中異常的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性與人類疾病發(fā)展密切相關(guān),發(fā)展可用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性準(zhǔn)確和靈敏檢測的生物傳感器對疾病診斷和藥物開發(fā)具有重要意義。然而,目前已報道的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測方法通常操作復(fù)雜且靈敏度較低。在本章節(jié)中,我們發(fā)展了一種分子信標(biāo)功能化量子點的單分子熒光生物傳感器用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測。本方法采用了淬滅劑/熒光團(tuán)(BHQ2/Cy5)雙標(biāo)記的分子信標(biāo)作為檢測探針,并將其組裝在量子點(605QD)表面形成605QD/探針/BHQ2/Cy5納米復(fù)合物。在這一納米結(jié)構(gòu)中,源自605QD和Cy5之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)信號被BHQ2所淬滅。在靶標(biāo)DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶Dam作用下,檢測探針被特異性甲基化,隨后被對DNA甲基化敏感的限制性內(nèi)切核酸酶DpnI切割,導(dǎo)致BHQ2分子從檢測探針中釋放,從而恢復(fù)FRET信號,并通過基于全內(nèi)反射熒光(Total internal reflection fluorescence,TIRF)成像的單分子計數(shù)方法進(jìn)行檢測。該生物傳感器僅需要單個檢測探針即可實現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的有效檢測,無需復(fù)雜的方案設(shè)計和繁瑣信號放大步驟。同時,該檢測方法具有高選擇性和高靈敏度,檢出限達(dá)到0.002 U/mL。此外,該生物傳感器還可以進(jìn)一步應(yīng)用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的篩選,在疾病診斷和藥物開發(fā)中具有重要的潛在應(yīng)用價值。(2)發(fā)展了一種基于連接擴(kuò)增反應(yīng)組裝的單個量子點熒光生物傳感器用于堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性檢測。ALP在多種細(xì)胞內(nèi)生理和病理過程中起重要作用,發(fā)展可用于ALP活性檢測的方法對于基礎(chǔ)生物學(xué)研究和臨床診斷都是非常重要的價值。在多種檢測方法中,熒光法是應(yīng)用最廣泛的ALP檢測方法。然而,它們往往需要繁復(fù)的程序制備無機(jī)納米材料和有機(jī)小分子探針。更重要的是,由于缺乏適當(dāng)?shù)男盘柗糯蠹夹g(shù),這些熒光方法的檢測靈敏度不足以檢測低濃度的靶標(biāo)。為了解決這些問題,我們發(fā)展了一種基于連接擴(kuò)增反應(yīng)組裝的單個量子點熒光生物傳感器用于定量檢測ALP活性。與常用的非核酸ALP底物相比,我們采用3'-磷酸化探針將酶活性信號轉(zhuǎn)化為易于擴(kuò)增的核酸信號。ALP能催化3'-磷酸化探針的去磷酸化,并使之在模板的存在下與輔助鏈連接。連接后的探針/輔助鏈可作為二級模板,通過循環(huán)的連接酶擴(kuò)增反應(yīng)催化形成多個Cy5/biotin雙標(biāo)記的信號探針。這些信號探針可組裝在量子點605QD表面,形成605QD/Cy5納米復(fù)合物,導(dǎo)致FRET發(fā)生,信號可通過單分子熒光方法檢測。該生物傳感器具有高敏度,檢測限為5.63×10~(-8) U/mL,并且無需復(fù)雜的材料與小分子探針化學(xué)合成步驟。同時,這一方法還能夠從細(xì)胞提取物中定量檢測內(nèi)源ALP活性,檢測限為1個細(xì)胞,并且可以區(qū)分不同細(xì)胞系的ALP表達(dá)水平。該生物傳感器還可進(jìn)一步用于ALP酶動力學(xué)分析和ALP抑制實驗,為ALP相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷應(yīng)用提供了新方法。(3)開發(fā)了一種基于無酶催化自組裝的單個量子點熒光納米傳感器用于循環(huán)microRNA檢測。微小RNA(microRNA)是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,并且可作為潛在生物標(biāo)志物用于臨床疾病診斷。然而,目前的microRNA測定方法通常較為繁瑣且靈敏度較低,不適于檢測低濃度靶標(biāo)如血液中的循環(huán)microRNA。為了提高檢測靈敏度,最常用的方法是酶輔助的核酸信號擴(kuò)增,但它們需要昂貴且不穩(wěn)定的酶、精確的熱循環(huán)和復(fù)雜的方案設(shè)計。在本章節(jié)中,我們發(fā)展了一種基于無酶催化自組裝的單個量子點熒光納米傳感器用于循環(huán)microRNA檢測。本方案中,microRNA的存在可催化兩個發(fā)夾DNA探針的循環(huán)雜交,包括生物素標(biāo)記的捕獲探針和Cy5標(biāo)記的檢測探針,形成生物素/Cy5雙標(biāo)記的DNA雙鏈體。這些雙鏈體可組裝在鏈霉親和素修飾的量子點605QD表面,誘導(dǎo)FRET發(fā)生,信號可以通過基于全內(nèi)反射熒光成像的單分子熒光方法檢測。該生物傳感器具有高選擇性和靈敏度,檢測限低至8.16×10~(-16) M,可用于準(zhǔn)確檢測細(xì)胞內(nèi)源microRNA和人血液樣中的循環(huán)microRNA。(4)報道了一種基于DNA納米機(jī)器的單分子熒光生物傳感器用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測。開發(fā)可以對稀有癌細(xì)胞如循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確和靈敏檢測的方法具有重要的臨床診斷和癌癥生物醫(yī)學(xué)研究價值。然而,目前大多數(shù)存在的癌細(xì)胞檢測方法通常靈敏度不足且操作復(fù)雜。在本章節(jié)中,我們構(gòu)建了一種新的基于DNA納米機(jī)器的單分子熒光生物傳感器用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測。該DNA納米機(jī)器由三種DNA組分構(gòu)成,包括檢測探針、信號探針和燃料序列。在與靶標(biāo)癌細(xì)胞結(jié)合后,檢測探針經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)換暴露出可與信號探針雜交的toehold位點,從而啟動級聯(lián)DNA鏈置換反應(yīng),激活DNA納米機(jī)器并釋放大量Cy5標(biāo)記的報告序列,最后通過基于全內(nèi)反射熒光成像的單分子熒光檢測對Cy5信號進(jìn)行定量檢測。該測定使用熵驅(qū)動的DNA納米機(jī)器進(jìn)行有效的癌細(xì)胞識別和信號擴(kuò)增,無需昂貴且不穩(wěn)定的抗體和酶,并且它能夠以高靈敏度和良好的特異性對癌細(xì)胞進(jìn)行一步檢測。此外,它還可以應(yīng)用于人血液樣品中稀有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行定量檢測。
【學(xué)位單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：O657.3;TP212
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 單分子熒光方法簡介
    1.2 單分子熒光生物傳感器研究進(jìn)展
        1.2.1 分離技術(shù)輔助的單分子熒光生物傳感器
        1.2.2 無需分離的單分子熒光生物傳感器
    1.3 本論文選題的目的及意義
    參考文獻(xiàn)
第二章 基于分子信標(biāo)功能化量子點的單分子熒光生物傳感器用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測
    2.1 引言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 材料
        2.2.2 發(fā)卡結(jié)構(gòu)檢測探針的制備
        2.2.3 探針的甲基化與切割反應(yīng)
        2.2.4 量子點納米結(jié)構(gòu)的組裝
        2.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.2.6 熒光測量
        2.2.7 單分子熒光檢測及數(shù)據(jù)分析
        2.2.8 抑制劑分析實驗
        2.2.9 血清樣品中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶檢測原理
        2.3.2 可行性分析
        2.3.3 實驗條件優(yōu)化
        2.3.4 靈敏度分析
        2.3.5 特異性分析
        2.3.6 回收率分析
        2.3.7 抑制劑篩選
    2.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第三章 基于連接擴(kuò)增反應(yīng)組裝的單個量子點熒光生物傳感器用于堿性磷酸酶活性檢測
    3.1 引言
    3.2 材料方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 ALP催化的去磷酸化
        3.2.3 連接擴(kuò)增反應(yīng)
        3.2.4 量子點納米結(jié)構(gòu)的組裝
        3.2.5 熒光測量
        3.2.6 單分子檢測和數(shù)據(jù)分析
        3.2.7 凝膠電泳
        3.2.8 ALP抑制劑分析實驗
        3.2.9 細(xì)胞提取物的制備
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 ALP檢測原理
        3.3.2 可行性分析
        3.3.3 實驗條件優(yōu)化
        3.3.4 靈敏度分析
        3.3.5 酶活動力學(xué)檢測
        3.3.6 特異性分析
        3.3.7 抑制劑篩選
        3.3.8 實際樣品檢測
    3.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第四章 基于無酶催化自組裝的單個量子點熒光納米傳感器用于循環(huán)microRNA檢測
    4.1 引言
    4.2 材料方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的制備
        4.2.3 MiR-21催化的量子點自組裝反應(yīng)
        4.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳
        4.2.5 熒光測量
        4.2.6 單分子熒光檢測及數(shù)據(jù)分析
        4.2.7 qRT-PCR檢測
        4.2.8 細(xì)胞培養(yǎng)及RNA提取
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 microRNA檢測原理
        4.3.2 可行性分析
        4.3.3 試驗條件優(yōu)化
        4.3.4 靈敏度分析
        4.3.5 特異性析
        4.3.6 qRT-PCR定量檢測
        4.3.7 細(xì)胞中microRNA檢測
        4.3.8 血液中循環(huán)microRNA檢測
    4.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第五章 基于DNA納米機(jī)器的單分子熒光生物傳感器用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測
    5.1 引言
    5.2 材料方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        5.2.3 癌細(xì)胞檢測
        5.2.4 熒光測量與凝膠成像
        5.2.5 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 腫瘤細(xì)胞檢測原理
        5.3.2 可行性分析
        5.3.3 特異性分析
        5.3.4 靈敏度分析
        5.3.5 穩(wěn)定性分析
        5.3.6 普適性分析
        5.3.7 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測
    5.4 總結(jié)
    參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)成果
致謝

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本文編號：2893120