脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)是構(gòu)成生物體遺傳功能、維持其生命的各種機(jī)能正常運(yùn)行的基本單元,已成為生命科學(xué)及生物分析領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。功能核酸的發(fā)展及基于基因擴(kuò)增的多種信號(hào)放大技術(shù)的利用,使得DNA在傳感器領(lǐng)域展現(xiàn)了越來(lái)越顯著的作用。電化學(xué)傳感器由于具有成本低、響應(yīng)快、選擇性好和易于微型化等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)發(fā)展迅速。為了提高檢測(cè)的靈敏度或更好地檢測(cè)出物質(zhì)的基因毒性,DNA常被用于構(gòu)筑多種類型的電化學(xué)傳感器。本論文針對(duì)DNA相關(guān)的電化學(xué)傳感器研究的關(guān)鍵問(wèn)題,即如何提高檢測(cè)的靈敏度、如何檢測(cè)物質(zhì)對(duì)DNA產(chǎn)生的損傷等,使用不同的材料、不同的修飾方法和不同的測(cè)定體系構(gòu)建了一系列新型的電化學(xué)生物傳感器,并將其應(yīng)用到毒性物質(zhì)的分析中。采用各種電化學(xué)技術(shù),如循環(huán)伏安法(CV)、電化學(xué)交流阻抗法(EIS)、差分脈沖伏安法(DPV)等,以及掃描電子顯微鏡(SEM)、投射電子顯微鏡(TEM)、紫外可見(jiàn)分光光度法(UV-vis)、X射線衍射(XRD)等技術(shù)詳細(xì)研究了電化學(xué)傳感器及其所用材料的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和檢測(cè)性能。本論文的主要研究工作如下:(1)利用自組裝法將Pb~(2+)依賴性脫氧核酶修飾到金電極上,結(jié)合雜交鏈反應(yīng)(HCR)和酶催化加氧化還原反應(yīng)的雙重放大信號(hào)策略,構(gòu)建了對(duì)Pb~(2+)超靈敏的新型DNA電化學(xué)生物傳感器。文中利用CV和EIS表征了修飾到不同程度的電極的電學(xué)性質(zhì),探索了裂解時(shí)間和HCR時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)Pb~(2+)測(cè)定的影響。并在適宜實(shí)驗(yàn)條件下,測(cè)得了傳感器的線性范圍(0.1-1000 nM)和檢測(cè)限(0.01 nM)。與其它傳感器相比,該傳感器的線性范圍較寬,檢測(cè)限較低。將此傳感器應(yīng)用到實(shí)際水樣中Pb~(2+)的檢測(cè),得到了可接受的加標(biāo)回收率,證明了該傳感器的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。(2)通過(guò)滴涂,將小牛胸腺dsDNA和聚(二烯丙基二甲基氯化銨)(poly(diallyldimethylammonium chloride),PDDA)吸附到玻碳電極表面,結(jié)合SnO_2納米粉(或WS_2微米粉)、HCl和H_2O_2混合體系構(gòu)建了新型的DNA損傷電化學(xué)生物傳感體系,并成功檢測(cè)出了SnO_2納米粉(或WS_2微米粉)的基因毒性。文中利用TEM和XRD表征了SnO_2納米粉和WS_2微米粉的形貌與結(jié)構(gòu);以Co(NH_3)_6~(3+)和Ru(NH_3)_6~(2+)為電化學(xué)指示劑,利用CV和DPV記錄了修飾電極浸入混合體系前后的電化學(xué)信號(hào),并以浸泡前后的信號(hào)差別證實(shí)了dsDNA損傷的發(fā)生,另外考察了浸泡時(shí)間與溶液組分對(duì)dsDNA損傷的影響,揭示了損傷發(fā)生的原理,即SnO_2納米粉(或WS_2微米粉)、HCl和H_2O_2混合體系中發(fā)生了類Fenton反應(yīng)。另外,該生物傳感器的構(gòu)建為其它納米材料基因毒性的檢測(cè)提供了研究思路。(3)利用電化學(xué)方法將聚(3,4-乙撐二氧噻吩)(PEDOT)和鉑納米粒子(Pt)修飾到玻碳電極上,從而顯著增加了中藥活性成分綠原酸的電化學(xué)信號(hào),由此建立了新型的高靈敏測(cè)定綠原酸的電化學(xué)傳感器,并研究了溶液中綠原酸與鮭魚(yú)精DNA的相互作用。為了獲得最大的檢測(cè)靈敏度,探索了支持電解質(zhì)的適宜酸度、掃描速度等實(shí)驗(yàn)條件。在適宜實(shí)驗(yàn)條件下,得到了比其它傳感器更寬的線性范圍(0.2-100μM)和更低的檢測(cè)限(0.05μM)。然后將該傳感器應(yīng)用于雙黃連注射液中綠原酸的含量測(cè)定,滿意的加標(biāo)回收率證明了該傳感器的準(zhǔn)確性和有效性。另外,將鮭魚(yú)精DNA加入到綠原酸溶液中,用CV記錄了加入前后的電化學(xué)信號(hào),考察了結(jié)合時(shí)間對(duì)電化學(xué)信號(hào)的影響。結(jié)果表明:它們的結(jié)合作用主要發(fā)生在接觸的前25 min里,結(jié)合模式主要是靜電模式,結(jié)合數(shù)為3,結(jié)合常數(shù)為1.62×10~3 L mol~(-1),由此可知它們的結(jié)合力是非共價(jià)鍵,力量較小。至此,文中制備的傳感器證明了綠原酸對(duì)DNA產(chǎn)生的影響。(4)通過(guò)滴涂將氧化石墨烯修飾到預(yù)處理過(guò)的電極表面上,從而大大增加了間苯三酚(m-THB)和對(duì)硝基苯酚(p-NP)的氧化電流,以此構(gòu)建了可同時(shí)測(cè)定m-THB和p-NP的電化學(xué)傳感器,并將其應(yīng)用到實(shí)際水樣中m-THB和p-NP的測(cè)定,最后研究了溶液中m-THB、p-NP與DNA的相互作用。文中分別利用TEM、FTIR和CV,表征了氧化石墨烯的形貌、結(jié)構(gòu)及其對(duì)電極表面電化學(xué)性質(zhì)的影響。考察了支持電解質(zhì)、酸度和掃速等條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。利用DPV,實(shí)現(xiàn)了m-THB和p-NP的單獨(dú)測(cè)定及其同時(shí)測(cè)定。最后將鯡魚(yú)精DNA加入到m-THB、p-NP的溶液中,利用紫外可見(jiàn)吸收與電化學(xué)兩種方法研究了它們的相互作用,結(jié)果表明,這兩種酚類物質(zhì)均以嵌插為主的模式與DNA結(jié)合,且結(jié)合數(shù)都為1,結(jié)合常數(shù)m-THB為1.58×10~5 L mol~(-1),p-NP為1.66×10~6 L mol~(-1),均比綠原酸大很多,說(shuō)明嵌插模式比靜電模式結(jié)合的更牢固。該傳感器得到的這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為兩種酚類的毒理解釋以及尋找合適的解毒劑提供了有用的參考信息。(5)利用DPV記錄了三種不同的支持電解質(zhì):磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、Tris-HCl和醋酸鹽緩沖溶液(ABS)中DNA四種堿基(鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)的電化學(xué)信號(hào),結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有在ABS中,可以同時(shí)得到四種堿基的氧化信號(hào),由此,構(gòu)建了裸玻碳電極上同時(shí)測(cè)定DNA四種堿基的電化學(xué)傳感體系。并將此傳感體系應(yīng)用到實(shí)際樣品小牛胸腺DNA和鮭魚(yú)精DNA的堿基檢測(cè)中,獲得了令人滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這種新型傳感體系的建立可為DNA其它方向的研究提供更簡(jiǎn)單方便的檢驗(yàn)方法。上述幾種基于DNA的電化學(xué)傳感器的建立,為毒性物質(zhì)的測(cè)定或基因毒性的分析提供了新穎的研究思路,也為相似物質(zhì)的檢測(cè)提供了靈敏度高、選擇性好的研究平臺(tái)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)礦業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O657.1;TP212.3
【部分圖文】：

1 緒論ctionIntroduction）核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)是一種具有雙鏈，可組成遺傳指令，引導(dǎo)生物發(fā)育和生命機(jī)能的運(yùn)作。示，它是由一對(duì)堿基互補(bǔ)的雙螺旋結(jié)構(gòu)的 Watson-Crick 對(duì)的堿基為鳥(niǎo)嘌呤（Guanine, G）配胞嘧啶（Cytosine, Cenine,A）配胸腺嘧啶（Thymine, T）。

博士學(xué)位論文們將在電極表面雜交形成，這一過(guò)程中必須控制合適的雜交條件。指示，即如何將雜交信息轉(zhuǎn)化為可測(cè)定的電化學(xué)信號(hào)，可以選擇合適示劑，也可以利用 DNA 本身的電化學(xué)活性。四是電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè)、電壓或電阻作為檢測(cè)信號(hào)，利用這些電信號(hào)在雜交前后的變化就可目標(biāo) DNA 的序列及含量等。

博士學(xué)位論文鏈斷裂（SSB），N-糖苷鍵斷裂會(huì)釋放出一個(gè)堿基錯(cuò)配（MM）來(lái)源于 DNA 損傷事件和/或不精受紫外線（UV light）引起化學(xué)改變的堿基位點(diǎn)（OX，與上面相同的位點(diǎn)和嘌呤的 C8）和烷基的 N7 是最易反應(yīng)的位點(diǎn)）以及容易脫胺（D烷基化，鳥(niǎo)嘌呤的 O-烷基化和胞嘧啶 4 號(hào)位或圖中的嘧啶和嘌呤環(huán)），會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生物學(xué)影atson-Crick 氫鍵系統(tǒng)。圖中還展示了作為龐大子，環(huán)丁烷嘧啶二聚體（紫外線損傷 DNA 的鳥(niǎo)嘌呤的癌癥治療藥物順鉑。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2839007