貴金屬納米材料具有極大的表面積、表面等離子體共振效應(yīng)、介電限制效應(yīng)等特點(diǎn),這些特點(diǎn)使其具有優(yōu)良的物理、化學(xué)、光學(xué)性能,包括穩(wěn)定性好(無(wú)漂白現(xiàn)象)、產(chǎn)量高、導(dǎo)電能力強(qiáng)、催化性能高以及生物相容性好,因此被廣泛用于電化學(xué)、生物傳感分析以及光熱治療等領(lǐng)域。本論文利用貴金屬納米材料極大的表面積以及熒光、表面等離子體共振效應(yīng)、等離子體共振耦合效應(yīng)等特性,結(jié)合DNA放大技術(shù),以尿嘧啶糖基化酶、miRNA、阿爾茨海默癥蛋白等具有重要臨床檢測(cè)意義的生物標(biāo)志物為研究對(duì)象,構(gòu)建了以下三種基于貴金屬納米材料與DNA納米技術(shù)有機(jī)結(jié)合的新型光學(xué)生物傳感器:(1)基于三通路結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的鏈置換反應(yīng)及DNA walker驅(qū)動(dòng)的G-四聯(lián)體球形核酸酶的形成用于催化魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng),構(gòu)建了一種高效、高靈敏性、高信噪比的用于尿嘧啶糖基化酶檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光傳感器。該體系的組成部分有:三通路結(jié)構(gòu)和球形核酸結(jié)構(gòu),其中,三通路結(jié)構(gòu)包括三種鏈:封閉walker功能的DNA發(fā)夾、帶有U堿基的探針、維持體系穩(wěn)定的底物鏈。球形核酸結(jié)構(gòu)(SNA)是以納米金為核表面DNA為殼所形成的核殼結(jié)構(gòu),在納米金的表面修飾有兩種鏈,一種鏈用于和三通路結(jié)構(gòu)中的具有walker功能的發(fā)夾雜交,另一種鏈為被封閉的可形成G-四聯(lián)體DNA酶的發(fā)夾。目標(biāo)物尿嘧啶糖基化酶特異性切除UP探針中的U堿基形成無(wú)嘌呤無(wú)嘧啶位點(diǎn)(AP位點(diǎn)),在內(nèi)切酶IV的作用下,使得UP探針斷裂并暴露出位于SA鏈中的toehold端,此時(shí),球形核酸中的鏈將和SA鏈雜交,引發(fā)toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)及后續(xù)的DNA walker反應(yīng),最終納米金表面被封閉的可形成G-四聯(lián)體的DNA全部被釋放,在血紅素和K~+存在的條件下,形成G-四聯(lián)體球形核酸酶,其具有非常強(qiáng)的類過(guò)氧化物酶活性,該結(jié)構(gòu)能夠在H_2O_2存在的條件下催化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。與傳統(tǒng)的DNA酶催化魯米諾發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)不同的是,將用于形成G-四聯(lián)體的DNA鏈修飾到納米金的表面,因納米金具有很大的比表面積,起到一種富集的效果,從而顯著提高所形成的G-四聯(lián)體球形核酸酶的類過(guò)氧化物酶活性,使化學(xué)發(fā)光信號(hào)顯著增強(qiáng)。該方法具有信噪比高、靈敏度優(yōu)良且選擇性良好的特點(diǎn),為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)尿嘧啶糖基化酶的濃度提供簡(jiǎn)單有效的平臺(tái)。(2)基于DNA三通路驅(qū)動(dòng)的鏈置換技術(shù)和light-up的銀簇?zé)晒馓结樈Y(jié)構(gòu),構(gòu)建了一種靈敏、簡(jiǎn)單的用于miRNA檢測(cè)的熒光生物傳感器。該方法的分析單元是由封閉G-rich序列的DNA發(fā)夾、目標(biāo)鏈的互補(bǔ)鏈、維持體系穩(wěn)定的底物鏈以及產(chǎn)生熒光信號(hào)的銀簇探針這四部分組成。目標(biāo)物miRNA通過(guò)和其互補(bǔ)鏈的雜交引發(fā)三通路結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而使被封閉的位于發(fā)夾中的toehold端被暴露,銀簇探針和toehold端進(jìn)行雜交,引發(fā)了toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)并使得銀簇部分靠近富G堿基部分,銀簇?zé)晒獗伙@著增強(qiáng)。該體系借助鏈置換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)鏈的快速遷移,不借助于酶,既減少了成本又能有效地降低了酶對(duì)銀簇發(fā)光的影響。該方法具有操作簡(jiǎn)單、信噪比高,熒光響應(yīng)強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),為miRNA的檢測(cè)提供可靠的依據(jù)。(3)基于目標(biāo)物介導(dǎo)的等離子體耦合所產(chǎn)生的表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)效應(yīng),構(gòu)建了一種簡(jiǎn)捷、快速、靈敏的能夠同時(shí)檢測(cè)兩種阿爾茨海默癥核心標(biāo)志物的傳感平臺(tái)。該方法通過(guò)設(shè)計(jì)了兩種標(biāo)記有不同拉曼染料(DTNB和4-AATP)的納米金,在兩種納米金的表面分別修飾有polyA封閉的目標(biāo)物的適配體,其中適配體用于捕獲目標(biāo)物,polyA寡核苷酸序列是用來(lái)代替巰基錨定AuNPs的表面。在目標(biāo)物Tau蛋白和β淀粉樣肽低聚體分別和各自的適配體特異性地結(jié)合后,polyA封閉的寡核苷酸將和AuNPs表面之間的結(jié)合發(fā)生松動(dòng),導(dǎo)致納米金在體系中發(fā)生團(tuán)聚,產(chǎn)生等離子體共振耦合效應(yīng),增強(qiáng)AuNPs之間染料的SERS信號(hào)。這是首次將polyA封閉的AuNPs用于蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)。該方法具有非常高的靈敏性和特異性,為阿爾茨海默癥的早期臨床診斷提供了簡(jiǎn)單可靠的方法。
【學(xué)位單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R318;TP212.14;TB383.1
【部分圖文】：

濟(jì)南大學(xué)碩士學(xué)位論文聯(lián)體/血紅素的復(fù)合物，具有類過(guò)氧化物酶的活性[1]，因此統(tǒng)的辣根過(guò)氧化物酶用于催化反應(yīng)，目前有文獻(xiàn)報(bào)道將 米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。利用端粒酶誘導(dǎo)鏈延伸出重復(fù)的 TTAGGG 序列，在聚合酶和信號(hào)放大，內(nèi)切酶切刻產(chǎn)生的鏈富含 G 堿基，該富 G 的 DN下形成 G-四聯(lián)體 DNA 酶，具有類過(guò)氧化物酶的活性，在過(guò)諾發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)來(lái)檢測(cè)單細(xì)胞水平過(guò)兩步信號(hào)放大可獲得端粒酶產(chǎn)物較低的檢測(cè)限，該反應(yīng)

圖 1.2 兩端封閉的 G-四聯(lián)體 DNA 酶通過(guò)化學(xué)發(fā)光信號(hào)用于 miRNA 的檢測(cè)原理圖[3]此外，魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)還可以與量子點(diǎn)結(jié)合，發(fā)生化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移，人利用 G-四聯(lián)體的形成來(lái)調(diào)控兩個(gè)量子點(diǎn)之間的距離，形成的 G-四聯(lián)體能催化魯發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，該化學(xué)發(fā)光和量子點(diǎn)之間能發(fā)生化學(xué)發(fā)光共量轉(zhuǎn)移，通過(guò)形成 G-四聯(lián)體來(lái)調(diào)控距離，使得化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移由 on 到 off 的切有 K+存在時(shí)，形成 G-四聯(lián)體，誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，此時(shí)信號(hào)為“on”態(tài)；在存在 18-冠醚-6 的時(shí)候，G-四聯(lián)體內(nèi)部的 K+被去除，G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)被破壞，拉近的量子點(diǎn)分開(kāi)，此時(shí)信號(hào)為“off”的狀態(tài)，如圖 1.3 所示[4]。

圖 1.2 兩端封閉的 G-四聯(lián)體 DNA 酶通過(guò)化學(xué)發(fā)光信號(hào)用于 miRNA 的檢測(cè)原理圖外，魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)還可以與量子點(diǎn)結(jié)合，發(fā)生化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)用 G-四聯(lián)體的形成來(lái)調(diào)控兩個(gè)量子點(diǎn)之間的距離，形成的 G-四聯(lián)體能催氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，該化學(xué)發(fā)光和量子點(diǎn)之間能發(fā)生化學(xué)發(fā)移，通過(guò)形成 G-四聯(lián)體來(lái)調(diào)控距離，使得化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移由 on 到 off存在時(shí)，形成 G-四聯(lián)體，誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，此時(shí)信號(hào)為“在存在 18-冠醚-6 的時(shí)候，G-四聯(lián)體內(nèi)部的 K+被去除，G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)被的量子點(diǎn)分開(kāi)，此時(shí)信號(hào)為“off”的狀態(tài)，如圖 1.3 所示[4]。

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