【摘要】：硒是生物必需的微量元素,對生物有機(jī)體的健康起到了非常重要的作用。納米硒(selenium nanoparticles,SeNPs)是一種紅色的單質(zhì)硒,相對于其它形式的硒而言,因其優(yōu)越的生物學(xué)活性和較低的毒性成為研究者研究的熱點(diǎn)。目前,關(guān)于納米硒的研究主要集中在化學(xué)合成的納米硒,而生物合成的納米硒的研究還較少。本學(xué)位論文利用實(shí)驗(yàn)室保藏的一株沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)N菌株還原亞硒酸鹽獲得高純度的生物源納米硒(biogenic SeNPs,bioSeNPs)。首先,對bioSeNPs的生物吸收利用率以及在體外誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞產(chǎn)生凋亡及其機(jī)制進(jìn)行了研究;其次,在構(gòu)建了裸鼠HepG2細(xì)胞移植瘤模型的基礎(chǔ)上,研究了bioSeNPs在裸鼠體內(nèi)抑制HepG2細(xì)胞移植瘤的生長及其機(jī)制。另外,利用bioSeNPs修飾玻碳電極(GCE),構(gòu)建了bioSeNPs/GCE非酶傳感器并對過氧化氫(H_2O_2)進(jìn)行了定量分析。研究結(jié)果主要表現(xiàn)在以下五個方面:1.R.palustris N菌株能夠?qū)單徕c還原為紅色bioSeNPs。在溫度為30℃、光照厭氧、培養(yǎng)基初始pH為7.0和接種量15%的條件下,R.palustris N菌株對濃度為1.0 mmol·L~(-1)的亞硒酸鈉的去除率達(dá)到99.9%以上,最大耐受亞硒酸鈉濃度大于8.0 mmol·L~(-1)。2.BioSeNPs在體外細(xì)胞水平上,表現(xiàn)出與亞硒酸鈉相似的提高含硒酶(GSH-Px和TrxR)活力的能力;在小鼠體內(nèi),bioSeNPs在硒的蓄積和提高含硒酶(GSH-Px和TrxR)活力上,同樣被證實(shí)具有與亞硒酸鈉相似的活性。3.BioSeNPs對人肝癌HepG2細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用。利用R.palustris N菌株還原亞硒酸鈉獲得高純度的bioSeNPs,粒徑在91.28-531.2 nm,平均為165.9 nm。BioSeNPs對人肝癌HepG2細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用且具有濃度效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)BioSeNPs處理的人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生皺縮,表面微絨毛消失,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡,細(xì)胞膜向內(nèi)包裹細(xì)胞內(nèi)容物并形成凋亡小體;流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,細(xì)胞凋亡率隨bioSeNPs濃度的增加而逐漸上升,并呈現(xiàn)一定的濃度效應(yīng)關(guān)系;細(xì)胞凋亡的發(fā)生依賴caspase級聯(lián)反應(yīng)的活化,推測死亡受體通路和線粒體通路均發(fā)揮了作用。4.BioSeNPs對裸鼠人肝癌HepG2細(xì)胞移植瘤的生長具有較強(qiáng)的抑制作用。抑制率高達(dá)51.72%。但是,BioSeNPs對裸鼠沒有顯著的毒副作用,推測bioSeNPs的抑瘤機(jī)制與其細(xì)胞毒性無關(guān),而提高機(jī)體抗氧化水平可能在這其中發(fā)揮了一定作用。5.利用R.palustris獲得的高純度bioSeNPs成功構(gòu)建了一種非酶傳感器。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的非酶傳感器在H_2O_2的定量分析上表現(xiàn)出靈敏度高且工藝簡單等特點(diǎn),檢出限達(dá)到33.3μmol·L~(-1),線性范圍在0.1-5.0 mmol·L~(-1)。綜上所述,本學(xué)位論文首次利用R.palustris獲得了高純度的bioSeNPs,證實(shí)bioSeNPs具有較高的生物吸收利用性,且可以通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生凋亡而抑制其生長;同時,bioSeNPs表現(xiàn)出對H_2O_2具有良好的催化性能。研究結(jié)果將為bioSeNPs用于開發(fā)新型抗肝癌藥物以及在化學(xué)非酶傳感器上的應(yīng)用奠定了科學(xué)依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TP212;R735.7
【圖文】：

本學(xué)位論文的研究思路和主要內(nèi)容Fig.1.1Experimentaldesignandmaincontentsofthisdissertation

如圖 2.1 可知，R. palustris N 菌株能夠在亞硒酸鈉培養(yǎng)基中生長，并且在培養(yǎng) 72 h 后達(dá)到對數(shù)生長期。N 菌株在不同亞硒酸鈉濃度（0-8.0 mmol·L-1）下的生長動力學(xué)顯示，隨著亞硒酸鈉濃度的增加 N 菌株可達(dá)到的最大菌體細(xì)胞數(shù)量（圖 2.1A）和蛋白質(zhì)含量（圖 2.1B）都顯著降低（P < 0.05）。菌體細(xì)胞數(shù)量與菌體蛋白質(zhì)含量的變化趨勢基本一致。隨著亞硒酸鈉濃度的增加，N 菌株的生長受到越來越嚴(yán)重的抑制。在發(fā)酵 120 h 后，與亞硒酸鈉濃度為 0 mmol·L-1相比，當(dāng)亞硒酸鈉濃度為 1.0 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、4.0 mmol·L-1和 8.0 mmol·L-1時，N 菌株生長受到的抑制率分別為 7.3％、24.5％、62.1％和 81.7％。為了進(jìn)一步評估 N 菌株對亞硒酸鈉的抗性，以菌體細(xì)胞對數(shù)生長期的平均生長速率（k）與亞硒酸鈉培養(yǎng)基中亞硒酸鈉濃度（c）進(jìn)行非線性擬合（如圖 2.2），亞硒酸鈉濃度對菌體細(xì)胞平均生長速率影響的回歸方程為：k =0.127exp（-0.29c），R2=0.978。根據(jù)回歸方程計算亞硒酸鈉對平均生長速率抑制 50% 時的濃度，即 EC50為 2.4mmol·L-1。

圖 2.2 亞硒酸鈉對沼澤紅假單胞菌菌體細(xì)胞平均生長速率的影響Fig. 2.2 Influence of selenite on average growth rate of R. palustri單胞菌對亞硒酸鈉的還原動力學(xué)研究3 所示，隨著 R. palustris N 菌株菌體的生長亞硒酸鈉濃·L-1亞硒酸鈉的條件下，當(dāng)菌體生物量處于對數(shù)增長期時速的增加，在 196 h 基本降解完成（圖 2.3A）。隨著亞硒株對亞硒酸鈉的還原能力明顯出現(xiàn)下降趨勢（圖 2.3B）。2.0、4.0 和 8.0 mmol·L-1時，216 h 后菌體的亞硒酸鈉還0％、31.7％和 2.4％。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2806124