【摘要】：硒是生物必需的微量元素,對生物有機體的健康起到了非常重要的作用。納米硒(selenium nanoparticles,SeNPs)是一種紅色的單質硒,相對于其它形式的硒而言,因其優(yōu)越的生物學活性和較低的毒性成為研究者研究的熱點。目前,關于納米硒的研究主要集中在化學合成的納米硒,而生物合成的納米硒的研究還較少。本學位論文利用實驗室保藏的一株沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)N菌株還原亞硒酸鹽獲得高純度的生物源納米硒(biogenic SeNPs,bioSeNPs)。首先,對bioSeNPs的生物吸收利用率以及在體外誘導人肝癌HepG2細胞產生凋亡及其機制進行了研究;其次,在構建了裸鼠HepG2細胞移植瘤模型的基礎上,研究了bioSeNPs在裸鼠體內抑制HepG2細胞移植瘤的生長及其機制。另外,利用bioSeNPs修飾玻碳電極(GCE),構建了bioSeNPs/GCE非酶傳感器并對過氧化氫(H_2O_2)進行了定量分析。研究結果主要表現在以下五個方面:1.R.palustris N菌株能夠將亞硒酸鈉還原為紅色bioSeNPs。在溫度為30℃、光照厭氧、培養(yǎng)基初始pH為7.0和接種量15%的條件下,R.palustris N菌株對濃度為1.0 mmol·L~(-1)的亞硒酸鈉的去除率達到99.9%以上,最大耐受亞硒酸鈉濃度大于8.0 mmol·L~(-1)。2.BioSeNPs在體外細胞水平上,表現出與亞硒酸鈉相似的提高含硒酶(GSH-Px和TrxR)活力的能力;在小鼠體內,bioSeNPs在硒的蓄積和提高含硒酶(GSH-Px和TrxR)活力上,同樣被證實具有與亞硒酸鈉相似的活性。3.BioSeNPs對人肝癌HepG2細胞具有顯著的生長抑制作用。利用R.palustris N菌株還原亞硒酸鈉獲得高純度的bioSeNPs,粒徑在91.28-531.2 nm,平均為165.9 nm。BioSeNPs對人肝癌HepG2細胞具有顯著的生長抑制作用且具有濃度效應關系。經BioSeNPs處理的人肝癌HepG2細胞發(fā)生皺縮,表面微絨毛消失,細胞內出現大量空泡,細胞膜向內包裹細胞內容物并形成凋亡小體;流式細胞術分析顯示,細胞凋亡率隨bioSeNPs濃度的增加而逐漸上升,并呈現一定的濃度效應關系;細胞凋亡的發(fā)生依賴caspase級聯反應的活化,推測死亡受體通路和線粒體通路均發(fā)揮了作用。4.BioSeNPs對裸鼠人肝癌HepG2細胞移植瘤的生長具有較強的抑制作用。抑制率高達51.72%。但是,BioSeNPs對裸鼠沒有顯著的毒副作用,推測bioSeNPs的抑瘤機制與其細胞毒性無關,而提高機體抗氧化水平可能在這其中發(fā)揮了一定作用。5.利用R.palustris獲得的高純度bioSeNPs成功構建了一種非酶傳感器。結果表明,實驗構建的非酶傳感器在H_2O_2的定量分析上表現出靈敏度高且工藝簡單等特點,檢出限達到33.3μmol·L~(-1),線性范圍在0.1-5.0 mmol·L~(-1)。綜上所述,本學位論文首次利用R.palustris獲得了高純度的bioSeNPs,證實bioSeNPs具有較高的生物吸收利用性,且可以通過誘導HepG2細胞產生凋亡而抑制其生長;同時,bioSeNPs表現出對H_2O_2具有良好的催化性能。研究結果將為bioSeNPs用于開發(fā)新型抗肝癌藥物以及在化學非酶傳感器上的應用奠定了科學依據和應用基礎。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TP212;R735.7
【圖文】：

本學位論文的研究思路和主要內容Fig.1.1Experimentaldesignandmaincontentsofthisdissertation

如圖 2.1 可知，R. palustris N 菌株能夠在亞硒酸鈉培養(yǎng)基中生長，并且在培養(yǎng) 72 h 后達到對數生長期。N 菌株在不同亞硒酸鈉濃度（0-8.0 mmol·L-1）下的生長動力學顯示，隨著亞硒酸鈉濃度的增加 N 菌株可達到的最大菌體細胞數量（圖 2.1A）和蛋白質含量（圖 2.1B）都顯著降低（P < 0.05）。菌體細胞數量與菌體蛋白質含量的變化趨勢基本一致。隨著亞硒酸鈉濃度的增加，N 菌株的生長受到越來越嚴重的抑制。在發(fā)酵 120 h 后，與亞硒酸鈉濃度為 0 mmol·L-1相比，當亞硒酸鈉濃度為 1.0 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、4.0 mmol·L-1和 8.0 mmol·L-1時，N 菌株生長受到的抑制率分別為 7.3％、24.5％、62.1％和 81.7％。為了進一步評估 N 菌株對亞硒酸鈉的抗性，以菌體細胞對數生長期的平均生長速率（k）與亞硒酸鈉培養(yǎng)基中亞硒酸鈉濃度（c）進行非線性擬合（如圖 2.2），亞硒酸鈉濃度對菌體細胞平均生長速率影響的回歸方程為：k =0.127exp（-0.29c），R2=0.978。根據回歸方程計算亞硒酸鈉對平均生長速率抑制 50% 時的濃度，即 EC50為 2.4mmol·L-1。

圖 2.2 亞硒酸鈉對沼澤紅假單胞菌菌體細胞平均生長速率的影響Fig. 2.2 Influence of selenite on average growth rate of R. palustri單胞菌對亞硒酸鈉的還原動力學研究3 所示，隨著 R. palustris N 菌株菌體的生長亞硒酸鈉濃·L-1亞硒酸鈉的條件下，當菌體生物量處于對數增長期時速的增加，在 196 h 基本降解完成（圖 2.3A）。隨著亞硒株對亞硒酸鈉的還原能力明顯出現下降趨勢（圖 2.3B）。2.0、4.0 和 8.0 mmol·L-1時，216 h 后菌體的亞硒酸鈉還0％、31.7％和 2.4％。

【參考文獻】

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本文編號：2806124