【摘要】：電化學(xué)傳感技術(shù)是通過(guò)檢測(cè)電流、電位、電阻、電容等信號(hào)的變化來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)。電化學(xué)傳感技術(shù)由于所需儀器簡(jiǎn)單、對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)選擇性好、分析速度快、且檢測(cè)成本低、易于微型化等優(yōu)點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)、工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。如何利用電化學(xué)傳感技術(shù)快速、高靈敏檢測(cè),是當(dāng)前的熱門(mén)研究課題之一。近年來(lái),碳納米材料的運(yùn)用為解決這些問(wèn)題提供了新思路。碳納米材料有:富勒烯、碳納米管、石墨烯、碳點(diǎn)等,碳納米材料不僅能夠穩(wěn)定存在,而且具有導(dǎo)電性好,電子傳輸速度快、比表面積大、反應(yīng)活性高、生物相容性好等特點(diǎn),因此在電化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注。核酸適配體(aptamer)是經(jīng)由體外指數(shù)性富集配件系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選后得到的寡核苷酸序列片段(DNA或RNA),能與相應(yīng)目標(biāo)物特異性緊密結(jié)合。核酸適配體具有可體外合成,周期短,高特異性、高親和力、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。生物放大技術(shù)由于具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、生物兼容性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于電分析化學(xué)中。一些生物放大技術(shù)如:酶催化放大、目標(biāo)循環(huán)放大、DNA擴(kuò)增技術(shù)等廣泛用于電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建中。因此,本論文基于碳納米材料、核酸適配體和DNA放大技術(shù),開(kāi)展了以下工作:1.構(gòu)建了一個(gè)新型的用碳點(diǎn)作為信號(hào)放大,硫堇(thionine,THi)作為信號(hào)探針的適配體的鉛離子電化學(xué)傳感器。首先巰基修飾的適配體通過(guò)金硫鍵的相互作用修飾到電極上,碳點(diǎn)通過(guò)π-π堆積相互作用進(jìn)一步修飾到電極上,電化學(xué)探針進(jìn)一步通過(guò)π-π堆積修飾到電極,在鉛離子存在的時(shí)候,適配體與鉛離子特異性結(jié)合,由單鏈轉(zhuǎn)變?yōu)镚4鏈體,導(dǎo)致碳點(diǎn)和硫堇離開(kāi)電極表面,電化學(xué)信號(hào)減小,達(dá)到了檢測(cè)鉛離子的目的。在最優(yōu)條件下檢測(cè)的線性范圍為:0.01-10 nM,檢出限:3.8 pM。該傳感器能夠?qū)λ畼又械你U離子進(jìn)行了加入回收實(shí)驗(yàn)回收率:95.0%-104.3%。2.構(gòu)建了基于氨基化氧化還原石墨烯(NH_2-rGO)對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)基因的電化學(xué)檢測(cè),在玻碳電極上修飾NH_2-rGO后利用π-π堆積將捕獲DNA(capture DNA)修飾到電極上,利用亞甲基藍(lán)(Methylene blue,MB)能與DNA分子中的G堿基特異性結(jié)合將MB修飾到電極上,在HIV基因存在時(shí),HIV能與capture DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈DNA,由于NH_2-rGO對(duì)單鏈DNA的吸附強(qiáng)于雙鏈DNA,造成雙鏈DNA脫離電極表面,電流信號(hào)減小,達(dá)到檢測(cè)的目的,在最優(yōu)條件下檢測(cè)的線性范圍為:0.05-1pM,檢出限:33 fM。該傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)血樣HIV進(jìn)行了加入回收實(shí)驗(yàn)回收率:96.0%-106.6%。該傳感器具有較高的選擇性與靈敏性、較低的檢出限和較寬的線性范圍、抗干擾能力強(qiáng),實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。3.構(gòu)建了基于三螺旋結(jié)構(gòu)的比率型的電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)。首先亞甲基藍(lán)修飾的DNA(MB-DNA)通過(guò)金硫鍵修飾到金電極表面,6-巰基-1-己醇(6-mercaptohexanol,MCH)封閉電極的非特異性位點(diǎn),通過(guò)Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對(duì)原則將二茂鐵修飾的DNA(Fc-DNA)修飾到電極上形成三螺旋結(jié)構(gòu),此時(shí),Fc靠近電極表面,電流信號(hào)最大,MB遠(yuǎn)離電極表面,電流信號(hào)最小,加入目標(biāo)檢測(cè)物ATP后,ATP與Fc-DNA特異性結(jié)合離開(kāi)電極表面,Fc信號(hào)減小,三螺旋結(jié)構(gòu)裂解,MB-DNA重新形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),MB信號(hào)增大形成比率信號(hào)用于ATP的檢測(cè)。檢測(cè)范圍:0.05-100 pM,檢出限:5.2 fM。具有較高的選擇性與靈敏性、較低的檢出限和較寬的線性范圍、抗干擾能力強(qiáng),實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。4.構(gòu)建了基于目標(biāo)循環(huán)放大和滾環(huán)擴(kuò)增放大(Rolling circle amplification,RCA)用于K-ras基因的檢測(cè)。首先Fc修飾的發(fā)卡DNA(Fc-DNA)修飾到電極上,K-ras存在時(shí)打開(kāi)發(fā)卡架構(gòu),核酸外切酶Ⅲ(Exonuclease Ⅲ,Exo Ⅲ)能夠?qū)c-DNA剪切,Fc被剪切離開(kāi)電極表面,信號(hào)減小;K-ras釋放循環(huán),經(jīng)過(guò)酶剪切后剩余的Fc-DNA的單鏈DNA做RCA的引物DNA(primer DNA)進(jìn)行RCA反應(yīng)產(chǎn)生大量的富含G堿基的DNA,氯化血紅素(hemin)能夠與富含G堿基的DNA結(jié)合形成G-quadruplex/hemin復(fù)合物,作為電化學(xué)信號(hào)輸出。在一定范圍內(nèi),K-ras濃度越大,Fc越小,G-quadruplex/hemin信號(hào)越大,形成一個(gè)比率型電化學(xué)傳感器。檢測(cè)范圍:0.5-10000 fM,檢出限:0.286 fM。
【學(xué)位授予單位】：南寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：O657.1;TP212.2
【圖文】：

圖 1.1 HCR 的步驟示意圖[34]A 鏈置換反應(yīng) 鏈置換反應(yīng)（Strand displacement reaction， SDR）是一條ld 結(jié)合區(qū)域引發(fā)分支遷移將雙鏈 DNA 中的一條單鏈置換出技術(shù)[34]。鏈置換反應(yīng)可以進(jìn)行是因?yàn)橥耆パa(bǔ)的雙鏈之間的完全互補(bǔ)的雙鏈。王思齊[35]等人構(gòu)建了基于 DNA 鏈置換反化學(xué)傳感器，其構(gòu)建過(guò)程如下：首先將一條 5 端修飾巰基的鍵固定到金電極上，修飾有電化學(xué)指示劑 MB 的信號(hào)探針通部分雜交的 DNA 雙鏈探針，暴露出未雜交的 toehold 結(jié)構(gòu)存在時(shí)，基于本身的高選擇性和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，目標(biāo)DNA鏈結(jié)合，DNA 鏈置換反應(yīng)開(kāi)始，將信號(hào)鏈釋放出來(lái)，造成檢測(cè)的目的，實(shí)現(xiàn)了寡核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，有效消除了外

圖 1.1 HCR 的步驟示意圖[34]鏈置換反應(yīng)置換反應(yīng)（Strand displacement reaction， SDR）結(jié)合區(qū)域引發(fā)分支遷移將雙鏈 DNA 中的一條單鏈術(shù)[34]。鏈置換反應(yīng)可以進(jìn)行是因?yàn)橥耆パa(bǔ)的雙鏈全互補(bǔ)的雙鏈。王思齊[35]等人構(gòu)建了基于 DNA 鏈學(xué)傳感器，其構(gòu)建過(guò)程如下：首先將一條 5 端修飾固定到金電極上，修飾有電化學(xué)指示劑 MB 的信號(hào)分雜交的 DNA 雙鏈探針，暴露出未雜交的 toeh在時(shí)，基于本身的高選擇性和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，目結(jié)合，DNA 鏈置換反應(yīng)開(kāi)始，將信號(hào)鏈釋放出來(lái)測(cè)的目的，實(shí)現(xiàn)了寡核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)，有效消

促使 RCA 的發(fā)生，產(chǎn)生很有大量重復(fù)的長(zhǎng) DNA 單鏈結(jié)合形成 G-quadruplex/hemin 復(fù)合物作為電化學(xué)信號(hào)輸出，在一定范度越大，形成的 G-quadruplex/hemin 越多，信號(hào)越大，兩者呈現(xiàn)系，從而達(dá)到檢測(cè)的目的，檢出限為 0.25 fM。酶輔助的 DNA 循環(huán)放大輔助DNA循環(huán)是通過(guò)酶的剪切或聚合釋放靶標(biāo)DNA或與靶標(biāo)DN，以參與下一輪雜交和釋放，使得單個(gè)靶標(biāo)或與靶標(biāo)相關(guān)的物質(zhì)多次信號(hào)放大[38]。袁若課題組[39]通過(guò)核酸內(nèi)切酶輔助目標(biāo)循環(huán)實(shí)現(xiàn)了。首先，在玻碳電極上修飾發(fā)卡探針 1（HP1），發(fā)夾探針 2（HP2形成適體-靶標(biāo)復(fù)合物，HP2部分HP1雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)形成具有N性識(shí)別位點(diǎn)，Nt.BbvC I 酶進(jìn)行剪切，雙鏈結(jié)構(gòu)裂解，釋放靶標(biāo)進(jìn)。剪切后剩余的 HP1 作為的 RCA 引物，觸發(fā) RCA 反應(yīng)產(chǎn)生大量長(zhǎng)嵌入 hemin 形成 G-quadruplex/hemin 復(fù)合物，可以提高魯米諾- H2OL 效率對(duì)共反應(yīng)物 H2O2的催化性能，放大檢測(cè)信號(hào)，達(dá)到高靈敏

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張金超;楊康寧;張海松;梁興杰;;碳納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望[J];化學(xué)進(jìn)展;2013年Z1期

本文編號(hào)：2795006