【摘要】：電化學傳感技術是通過檢測電流、電位、電阻、電容等信號的變化來檢測目標物質。電化學傳感技術由于所需儀器簡單、對目標檢測物質選擇性好、分析速度快、且檢測成本低、易于微型化等優(yōu)點,在生物醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測、食品檢測、工業(yè)等領域具有廣泛的應用前景。如何利用電化學傳感技術快速、高靈敏檢測,是當前的熱門研究課題之一。近年來,碳納米材料的運用為解決這些問題提供了新思路。碳納米材料有:富勒烯、碳納米管、石墨烯、碳點等,碳納米材料不僅能夠穩(wěn)定存在,而且具有導電性好,電子傳輸速度快、比表面積大、反應活性高、生物相容性好等特點,因此在電化學領域得到了廣泛的關注。核酸適配體(aptamer)是經(jīng)由體外指數(shù)性富集配件系統(tǒng)進化技術篩選后得到的寡核苷酸序列片段(DNA或RNA),能與相應目標物特異性緊密結合。核酸適配體具有可體外合成,周期短,高特異性、高親和力、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。生物放大技術由于具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、生物兼容性和特異性高等優(yōu)點而被廣泛應用于電分析化學中。一些生物放大技術如:酶催化放大、目標循環(huán)放大、DNA擴增技術等廣泛用于電化學生物傳感器的構建中。因此,本論文基于碳納米材料、核酸適配體和DNA放大技術,開展了以下工作:1.構建了一個新型的用碳點作為信號放大,硫堇(thionine,THi)作為信號探針的適配體的鉛離子電化學傳感器。首先巰基修飾的適配體通過金硫鍵的相互作用修飾到電極上,碳點通過π-π堆積相互作用進一步修飾到電極上,電化學探針進一步通過π-π堆積修飾到電極,在鉛離子存在的時候,適配體與鉛離子特異性結合,由單鏈轉變?yōu)镚4鏈體,導致碳點和硫堇離開電極表面,電化學信號減小,達到了檢測鉛離子的目的。在最優(yōu)條件下檢測的線性范圍為:0.01-10 nM,檢出限:3.8 pM。該傳感器能夠對水樣中的鉛離子進行了加入回收實驗回收率:95.0%-104.3%。2.構建了基于氨基化氧化還原石墨烯(NH_2-rGO)對人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)基因的電化學檢測,在玻碳電極上修飾NH_2-rGO后利用π-π堆積將捕獲DNA(capture DNA)修飾到電極上,利用亞甲基藍(Methylene blue,MB)能與DNA分子中的G堿基特異性結合將MB修飾到電極上,在HIV基因存在時,HIV能與capture DNA堿基互補配對形成雙鏈DNA,由于NH_2-rGO對單鏈DNA的吸附強于雙鏈DNA,造成雙鏈DNA脫離電極表面,電流信號減小,達到檢測的目的,在最優(yōu)條件下檢測的線性范圍為:0.05-1pM,檢出限:33 fM。該傳感器能夠實現(xiàn)對血樣HIV進行了加入回收實驗回收率:96.0%-106.6%。該傳感器具有較高的選擇性與靈敏性、較低的檢出限和較寬的線性范圍、抗干擾能力強,實現(xiàn)實際樣品的檢測等優(yōu)點。3.構建了基于三螺旋結構的比率型的電化學傳感器用于檢測三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)。首先亞甲基藍修飾的DNA(MB-DNA)通過金硫鍵修飾到金電極表面,6-巰基-1-己醇(6-mercaptohexanol,MCH)封閉電極的非特異性位點,通過Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對原則將二茂鐵修飾的DNA(Fc-DNA)修飾到電極上形成三螺旋結構,此時,Fc靠近電極表面,電流信號最大,MB遠離電極表面,電流信號最小,加入目標檢測物ATP后,ATP與Fc-DNA特異性結合離開電極表面,Fc信號減小,三螺旋結構裂解,MB-DNA重新形成發(fā)卡結構,MB信號增大形成比率信號用于ATP的檢測。檢測范圍:0.05-100 pM,檢出限:5.2 fM。具有較高的選擇性與靈敏性、較低的檢出限和較寬的線性范圍、抗干擾能力強,實現(xiàn)實際樣品的檢測等優(yōu)點。4.構建了基于目標循環(huán)放大和滾環(huán)擴增放大(Rolling circle amplification,RCA)用于K-ras基因的檢測。首先Fc修飾的發(fā)卡DNA(Fc-DNA)修飾到電極上,K-ras存在時打開發(fā)卡架構,核酸外切酶Ⅲ(Exonuclease Ⅲ,Exo Ⅲ)能夠將Fc-DNA剪切,Fc被剪切離開電極表面,信號減小;K-ras釋放循環(huán),經(jīng)過酶剪切后剩余的Fc-DNA的單鏈DNA做RCA的引物DNA(primer DNA)進行RCA反應產生大量的富含G堿基的DNA,氯化血紅素(hemin)能夠與富含G堿基的DNA結合形成G-quadruplex/hemin復合物,作為電化學信號輸出。在一定范圍內,K-ras濃度越大,Fc越小,G-quadruplex/hemin信號越大,形成一個比率型電化學傳感器。檢測范圍:0.5-10000 fM,檢出限:0.286 fM。
【學位授予單位】：南寧師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：O657.1;TP212.2
【圖文】：

圖 1.1 HCR 的步驟示意圖[34]A 鏈置換反應 鏈置換反應（Strand displacement reaction， SDR）是一條ld 結合區(qū)域引發(fā)分支遷移將雙鏈 DNA 中的一條單鏈置換出技術[34]。鏈置換反應可以進行是因為完全互補的雙鏈之間的完全互補的雙鏈。王思齊[35]等人構建了基于 DNA 鏈置換反化學傳感器，其構建過程如下：首先將一條 5 端修飾巰基的鍵固定到金電極上，修飾有電化學指示劑 MB 的信號探針通部分雜交的 DNA 雙鏈探針，暴露出未雜交的 toehold 結構存在時，基于本身的高選擇性和反應動力學特點，目標DNA鏈結合，DNA 鏈置換反應開始，將信號鏈釋放出來，造成檢測的目的，實現(xiàn)了寡核苷酸多態(tài)性的檢測，有效消除了外

圖 1.1 HCR 的步驟示意圖[34]鏈置換反應置換反應（Strand displacement reaction， SDR）結合區(qū)域引發(fā)分支遷移將雙鏈 DNA 中的一條單鏈術[34]。鏈置換反應可以進行是因為完全互補的雙鏈全互補的雙鏈。王思齊[35]等人構建了基于 DNA 鏈學傳感器，其構建過程如下：首先將一條 5 端修飾固定到金電極上，修飾有電化學指示劑 MB 的信號分雜交的 DNA 雙鏈探針，暴露出未雜交的 toeh在時，基于本身的高選擇性和反應動力學特點，目結合，DNA 鏈置換反應開始，將信號鏈釋放出來測的目的，實現(xiàn)了寡核苷酸多態(tài)性的檢測，有效消

促使 RCA 的發(fā)生，產生很有大量重復的長 DNA 單鏈結合形成 G-quadruplex/hemin 復合物作為電化學信號輸出，在一定范度越大，形成的 G-quadruplex/hemin 越多，信號越大，兩者呈現(xiàn)系，從而達到檢測的目的，檢出限為 0.25 fM。酶輔助的 DNA 循環(huán)放大輔助DNA循環(huán)是通過酶的剪切或聚合釋放靶標DNA或與靶標DN，以參與下一輪雜交和釋放，使得單個靶標或與靶標相關的物質多次信號放大[38]。袁若課題組[39]通過核酸內切酶輔助目標循環(huán)實現(xiàn)了。首先，在玻碳電極上修飾發(fā)卡探針 1（HP1），發(fā)夾探針 2（HP2形成適體-靶標復合物，HP2部分HP1雜交形成雙鏈結構形成具有N性識別位點，Nt.BbvC I 酶進行剪切，雙鏈結構裂解，釋放靶標進。剪切后剩余的 HP1 作為的 RCA 引物，觸發(fā) RCA 反應產生大量長嵌入 hemin 形成 G-quadruplex/hemin 復合物，可以提高魯米諾- H2OL 效率對共反應物 H2O2的催化性能，放大檢測信號，達到高靈敏

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 張金超;楊康寧;張海松;梁興杰;;碳納米材料在生物醫(yī)學領域的應用現(xiàn)狀及展望[J];化學進展;2013年Z1期

本文編號：2795006