【摘要】：致病菌與糖相互作用的研究可以為致病菌的分離、富集、檢測(cè)、鑒別、生物膜抑制及抗生素替代藥物的篩選提供新的解決方案。然而,快速、靈敏、可靠的研究方法與技術(shù)缺乏是制約其發(fā)展的重要原因。生物傳感器以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在致病菌與糖相互作用的研究中展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。本論文針對(duì)目前致病菌與糖相互作用研究需要依賴大型儀器、需要熒光標(biāo)記等問題,提出利用快速、靈敏、無需標(biāo)記且易于集成化和微型化的電化學(xué)阻抗生物傳感器來研究致病菌與糖的相互作用,結(jié)合等溫吸附模型建立定量計(jì)算致病菌與糖結(jié)合親和力的方法。針對(duì)體外致病菌與糖結(jié)合親和力弱和選擇性差等難題,構(gòu)建糖納米傳感界面和仿生擬糖蛋白界面,并結(jié)合電化學(xué)阻抗譜(EIS)和表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)雙檢測(cè)模式構(gòu)建可以同時(shí)獲取多種有效信息的糖生物傳感器,利用其研究致病菌與糖的相互作用和鑒別表達(dá)1型菌毛的不同致病菌�；谥虏【c糖的相互作用,通過糖生物傳感器、糖基化磁性微球與微流控芯片的結(jié)合,為快速、有效評(píng)價(jià)糖類抗粘附試劑的效能和沙門氏菌的定量檢測(cè)提供新方法。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下:(1)構(gòu)建Man/MUA-MH/Au傳感界面,開展致病菌與甘露糖相互作用研究。利用自組裝法和共價(jià)鍵固定的方法構(gòu)建具有生物活性且穩(wěn)定性良好的Man/MUA-MH/Au生物傳感界面。通過阻抗檢測(cè)和Randless等效電路模型解析,獲得致病菌在甘露糖傳感界面上對(duì)應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移阻抗(R_(et))數(shù)據(jù),根據(jù)弗魯姆基等溫線(Frumkin isotherm)模型,計(jì)算得出細(xì)菌與甘露糖的結(jié)合親和力,以此建立基于阻抗檢測(cè)的致病菌-糖相互作用研究的新方法。利用該方法研究了Salmonella typhimurium ATCC14028和Escherichia coli JM109與該傳感界面上甘露糖的相互作用。結(jié)果顯示,兩種致病菌與傳感界面上甘露糖的親和力分別為K_(ADS(S.T.))=2.16×10~6(CFU/mL)~(-1)和K_(ADS(JM109))=5.84×10~3(CFU/mL)~(-1),表明該傳感界面對(duì)S.typhimurium ATCC14028具有較強(qiáng)的選擇性吸附能力,對(duì)于表達(dá)1型菌毛的E.coli JM109也具有一定的吸附能力。該方法為細(xì)菌/細(xì)胞與界面上生物分子的相互作用的定量研究提供了簡(jiǎn)單、快速、可靠的新途徑。(2)構(gòu)建Man/MUA-MH/Au NPs納米傳感界面,開展致病菌與糖相互作用的雙模式檢測(cè)研究。采用恒電位沉積法在干凈的金電極表面制備金納米粒子Au NPs,通過化學(xué)自組裝法在其表面修飾得到Man/MUA-MH/Au NPs@Au納米傳感界面。采用EIS方法考察該界面與S.typhimurium ATCC14028、E.coli JM109、E.coli DH5α、Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa五種致病菌的相互作用。結(jié)果顯示,Man/MUA-MH/AuNPs糖界面能選擇性識(shí)別表達(dá)1型菌毛(含F(xiàn)imH粘附素)的S.typhimurium ATCC14028和E.coli JM109,結(jié)合親和力分別為6.859×10~(23) M~(-1)和2.054×10~(17) M~(-1),而不識(shí)別其它細(xì)菌。進(jìn)一步利用納米傳感界面上納米金的SERS效應(yīng),原位測(cè)試獲得界面捕獲的致病菌的SERS圖譜,利用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)實(shí)現(xiàn)S.typhimurium ATCC14028和E.coli JM109的有效鑒別。該方法解決了目前糖生物傳感器不能區(qū)別能與同一糖選擇性識(shí)別的不同細(xì)菌的難題。(3)基于納米擬糖蛋白傳感界面的構(gòu)建,研制集成阻抗傳感細(xì)菌芯片,開展抗細(xì)菌粘附試劑效能測(cè)試研究。S.typhimurium和表達(dá)1型菌毛的E.coli與宿主細(xì)胞表面上糖蛋白而不是游離的糖選擇性識(shí)別。所以,提出在納米尺度上構(gòu)建擬糖蛋白界面Man-BSA以更好的模擬細(xì)胞表面聚糖的呈現(xiàn)和排布方式,促進(jìn)多效價(jià)相互作用的發(fā)生。設(shè)計(jì)并制備集成進(jìn)樣區(qū)、混合區(qū)、緩沖區(qū)、檢測(cè)區(qū)和出樣區(qū)的微流控芯片,在檢測(cè)區(qū)集成具有新結(jié)構(gòu)的微電極,通過恒電位沉積法在微電極表面制備了Au NPs,在Au NPs表面通過化學(xué)自組裝法構(gòu)建了納米甘露糖-牛血清蛋白擬糖蛋白界面Man-BSA@Au NPs。利用EIS測(cè)定不同細(xì)菌對(duì)該界面的相互作用特性參數(shù),考察、分析并評(píng)價(jià)該擬糖蛋白界面對(duì)S.typhimurium的選擇性識(shí)別效能。結(jié)果表明,Man-BSA@Au NPs對(duì)S.typhimurium具有明顯的選擇性和高的結(jié)合親和力,而D-Man、Me-Man、Phenyl-Man、Mannatide四種甘露糖苷類試劑均可抑制S.typhimurium粘附效果,抗粘附性能依次為Phenyl-ManMannatideMe-ManD-Man,與文獻(xiàn)中傳統(tǒng)方法測(cè)試結(jié)果一致,說明在微流控芯片的特定功能區(qū)構(gòu)建仿生界面可實(shí)現(xiàn)糖類化合物抗粘附效果的有效測(cè)評(píng)。本研究為致病菌抗粘附藥物的效能評(píng)價(jià)提供了簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速的方法和技術(shù)途徑。(4)基于甘露糖選擇性識(shí)別沙門氏菌和大腸桿菌的特性,開展該類致病菌檢測(cè)的新方法研究。研究基于Man/MUA-MH/Au、Man/MUA-MH/Au NPs和Man-BSA@Au NPs三種甘露糖傳感界面的電化學(xué)阻抗生物傳感器對(duì)S.typhimurium的檢測(cè)性能。檢測(cè)限分別為50 CFU/mL、10 CFU/mL、5 CFU/mL。其中基于Man-BSA@Au NPs傳感界面和微流控芯片相結(jié)合的檢測(cè)方法展現(xiàn)出優(yōu)異的性能,除了獲得較低的檢測(cè)限外,只需要30 min即可完成檢測(cè)。建立糖基化磁性微球分選-DEP分離富集-EIS原位檢測(cè)的微流控芯片沙門氏菌檢測(cè)新方法,設(shè)計(jì)并制備含有進(jìn)樣區(qū)、“Tesla”結(jié)構(gòu)混合區(qū)、檢測(cè)區(qū)和出樣區(qū)的玻璃-PDMS復(fù)合式微流控芯片。實(shí)驗(yàn)通過含有氨基的甘露糖苷與含有羧基的四氧化三鐵磁性微球反應(yīng),制備甘露糖苷修飾的磁性微球(phenyl-Man@Fe_3O_4),平均粒徑為200 nm。在芯片的“Tesla”結(jié)構(gòu)混合區(qū),細(xì)菌合成樣本與糖基化磁性微球充分混合,在含有陣列微電極的檢測(cè)區(qū)通過介電電泳力(DEP)將糖基化磁性微球標(biāo)記的沙門氏菌富集在叉指電極之間,再利用EIS原位檢測(cè)細(xì)菌的含量。結(jié)果顯示,阻抗變化值?Z與細(xì)菌濃度[C]在100~5×10~4CFU/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測(cè)限為100 CFU/mL。該檢測(cè)限較文獻(xiàn)報(bào)道的DEP-EIS細(xì)菌檢測(cè)方法降低了1個(gè)數(shù)量級(jí),證明了糖基化磁性微球同時(shí)具有EIS檢測(cè)信號(hào)放大的功能。所建立的方法將檢測(cè)時(shí)間縮短在1 h內(nèi),在致病菌的快速檢測(cè)和感染性疾病的快速診斷中具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

1 緒 論介導(dǎo)的致病菌粘附簡(jiǎn)介是生物體進(jìn)行新陳代謝所需能量的主要來源，同時(shí)，它還調(diào)節(jié)，具有重要的生物學(xué)功能[1]。糖的生物學(xué)功能主要是通過與蛋白來實(shí)現(xiàn)的。可選擇性識(shí)別糖的蛋白質(zhì)主要包括單克隆抗體、酶集素[2]。其中，糖-凝集素選擇性識(shí)別相關(guān)的生理學(xué)及病理學(xué)過感染、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、受精、癌癥轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)是致病菌感染人畜的先決條件，它受到多種理化因素和生物因附素和受體共同作用的結(jié)果，具有宿主選擇性、組織選擇性和作為毒力因子之一的菌毛，一般會(huì)參與致病菌對(duì)宿主細(xì)胞的選擇主要途徑是多個(gè)菌毛凝集素與宿主細(xì)胞表面多個(gè)聚糖發(fā)生選擇性）。

造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[56, 57]。最近研究表明，糖納米粒子可以通過抑制細(xì)菌粘附來擾亂生物膜的形成（圖1.4）。Barras 等[58]和 Khanal 等[59]分別合成了 Man 修飾的金剛石納米粒子 ND-Man和 ND-Man3，，利用吸光度法測(cè)試其對(duì) E. coli 在 96 孔板聚氯乙烯（PVC）表面上培養(yǎng) 24 h 后生物膜形成狀況的影響。結(jié)果表明，當(dāng) ND-Man 的濃度為 80 μmol/L，ND-Man3的濃度為 21 μmol/L 時(shí)，可以顯著抑制 E. coil 生物膜的形成。這可能是由于糖納米粒子阻止了菌毛 FimH 粘附蛋白對(duì) PVC 的粘附。當(dāng)細(xì)菌先在 96 孔板上培養(yǎng) 24 h，等生物膜形成之后，再加入該糖納米粒子，則不能再影響細(xì)菌生物膜的狀態(tài)。圖 1.4 糖納米粒子抑制細(xì)菌生物膜原理示意圖Fig. 1.4 Schematic representation of ND-mannose ability to inhibit of biofilm formationP. aeruginosa 生物膜的形成與其表面的凝聚素 LecA 和 LecB 相關(guān)。Johansson等[60]篩選出了兩種針對(duì) LecB 的巖藻糖多肽樹枝狀大分子 FD2(C-Fuc-LysProLeu)4(LysPheLysIle)2LysHisIleNH2和 PA8 (OFuc -LysAlaAsp)4(LysSerGlyAla)2LysHisIleNH2，其中 FD2 可以有效的抑制 P. aeruginosa 生物膜的形成（IC50=10μmol/L）及有效驅(qū)散已經(jīng)形成的生物膜。這說明 LecB 的多效價(jià)糖類抑制劑可以作為抑制和驅(qū)散生物膜的有效試劑。Reymond 課題組制備了多種半乳糖苷修飾的多肽樹枝狀大分子，通過抑制 LecA 來抑制或驅(qū)散 P. aeruginosa 生物膜[61-63]
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O641.3;TP212.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王霄;許吉英;陳義;;生物分子相互作用動(dòng)力學(xué)的表面等離子體共振研究方法[J];化學(xué)進(jìn)展;2015年05期

2 黃毅;黃金花;謝青季;姚守拙;;糖-蛋白質(zhì)相互作用[J];化學(xué)進(jìn)展;2008年06期

本文編號(hào)：2701937