本文關(guān)鍵詞：基于限制性核酸內(nèi)切酶放大技術(shù)的miRNA檢測(cè)生物傳感器

  更多相關(guān)文章： 3-WJ結(jié)構(gòu) EXPAR 等溫協(xié)同酶放大 miRNA檢測(cè)

【摘要】：微小RNA(miRNA)的異常表達(dá)量與癌癥和疾病的發(fā)展相關(guān),所以miRNA已經(jīng)成為一種能夠?qū)Π┌Y診斷和治療組織性的生物標(biāo)志物。因此,快速高效檢測(cè)miRNA新方法的研究變得刻不容緩。最近,在限制性核酸內(nèi)切酶和聚合酶的基礎(chǔ)上,自動(dòng)的聚合-剪切等溫?cái)U(kuò)增酶放大過(guò)程已廣泛地用于miRNA檢測(cè)。EXPAR是一種有前途的高靈敏度,低成本和可用于臨床樣品miRNA實(shí)時(shí)檢測(cè)的非線性放大方法。由于高擴(kuò)增效率,EXPAR能在短時(shí)間內(nèi)迅速放大寡核苷酸鏈數(shù)。我們基于EXPAR放大技術(shù)和酶的使用,設(shè)計(jì)了兩個(gè)體系來(lái)檢測(cè)miRNA。一個(gè)是基于三通路結(jié)構(gòu)(3-WJ)驅(qū)動(dòng)的trigger輔助的指數(shù)酶放大(T-EXPEA)超靈敏檢測(cè)miRNA;一個(gè)是二次使用分子信標(biāo)的指數(shù)酶放大反應(yīng)用于超靈敏檢測(cè)miRNA。我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型的用三通路(3-WJ)結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的trigger輔助的指數(shù)酶放大(T-EXPEA)超靈敏檢測(cè)miRNA方法,該實(shí)驗(yàn)方案在癌癥診斷和治療領(lǐng)域有很大應(yīng)用潛力。在本試驗(yàn)中,目標(biāo)物miRNA可以打開(kāi)發(fā)夾探針,并引發(fā)反應(yīng),因此特異性地形成穩(wěn)定的3-WJ結(jié)構(gòu)。然后,它可以在聚合酶和限制性核酸內(nèi)切酶的配合下產(chǎn)生下放大。所產(chǎn)生的triggers可用于打開(kāi)分子信標(biāo)(MB)和引發(fā)T-EXPEA反應(yīng)。在T-EXPEA部分,產(chǎn)生的指數(shù)triggers來(lái)啟動(dòng)新的T-EXPEA,獲得很大增幅的熒光信號(hào)和放大效率。我們方法的特點(diǎn)在于將T-EXPEA和3-WJ結(jié)構(gòu)結(jié)合用于熒光miRNA檢測(cè)。值得注意的是,在T-EXPEA部分與3-WJ部分trigger的序列設(shè)計(jì)是相同的。另外,在發(fā)夾探針和MB中設(shè)計(jì)的限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)是相同的內(nèi)切酶Nt.BbvCI,該設(shè)計(jì)提高了反應(yīng)效率,減少了成本。這種方法可以定量檢測(cè)特異性序列miRNA,從10 aM到10 pM的動(dòng)態(tài)范圍,最低檢出限是7.8 aM。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中,我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)可以二次利用分子信標(biāo)MB、使之二次打開(kāi)從而產(chǎn)生一個(gè)疊加的呈指數(shù)放大趨勢(shì)的熒光信號(hào)用于超靈敏快速檢測(cè)miRNA。在該設(shè)計(jì)中,目標(biāo)物miRNA首先引發(fā)產(chǎn)生一個(gè)3-WJ結(jié)構(gòu),在聚合酶和內(nèi)切酶的共同作用下,初次打開(kāi)一個(gè)發(fā)夾狀分子信標(biāo),產(chǎn)生初級(jí)的熒光信號(hào)。并且產(chǎn)生的primer探針可以與一個(gè)發(fā)夾探針結(jié)合,并且在聚合酶和內(nèi)切酶的共同作用下產(chǎn)生trigger鏈,此trigger鏈又可以再次引發(fā)分子信標(biāo)MB,在聚合酶和內(nèi)切酶的共同作用下使之打開(kāi),產(chǎn)生二級(jí)熒光信號(hào),產(chǎn)生指數(shù)型放大。該方法的檢測(cè)范圍較廣,為10 aM-1 pM,檢出限為3.5 aM。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q503;TP212.3

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本文編號(hào)：1261764