光片熒光顯微用一層光束薄片從側(cè)面激發(fā)樣品,并在垂直于光片的方向上用顯微物鏡和相機拍攝樣品熒光圖像,通過軸向掃描光片或移動樣品逐面成像,獲取不同深度處的層析圖像并實現(xiàn)樣品三維信息重構(gòu)。與共聚焦顯微技術相比,光片熒光顯微因具有三維層析成像速度快、光漂白弱和光毒性小等優(yōu)點成為了生命科學領域中重要的三維成像工具。目前光片熒光顯微系統(tǒng)大多使用高斯型光片場,大視場觀測需以犧牲圖像質(zhì)量和軸向分辨率為代價。掃描貝塞爾光束生成的光片雖然能擴大觀測視場,但它的同心環(huán)狀旁瓣會產(chǎn)生較強的離焦背景,降低圖像信噪比和軸向分辨率。如何在不損失軸向分辨率的前提下擴大光片熒光顯微成像系統(tǒng)的觀測視場是光片熒光顯微技術中亟待解決的問題。本文提出并生成了貝塞爾光束的互補光束,分別掃描貝塞爾光束和互補光束拍攝熒光圖像,取其強度差值可以得到去除離焦背景的熒光圖像,從而實現(xiàn)高時空分辨率、大觀測視場的熒光三維顯微成像。本文主要研究工作包含以下幾方面:1、設計并優(yōu)化了貝塞爾光束的互補光束。針對貝塞爾光片旁瓣激發(fā)離焦背景的問題構(gòu)想出一種貝塞爾光束的互補光束,其掃描光片場恰好是貝塞爾光片的旁瓣部分。研究了貝塞爾光束和馬丟光束等無衍射光束頻... 

【文章來源】：中國科學院大學(中國科學院西安光學精密機械研究所)陜西省

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

綠色熒光蛋白結(jié)構(gòu)與種類(a)綠色熒光蛋白1GFL的結(jié)構(gòu)圖，來自TheProteinDataBank(PDB)(b)綠色熒光蛋白和紅

[7]Figure 1.2 Schematic of Confocal Laser Scanning Microscope從圖1.2c可知，層析能力提高的CLSM技術仍不能實現(xiàn)各向同性的分辨率。與 CLSM 技術濾除離焦背景信號的思路相比，另一種相反方案是抑制離焦部分熒光蛋白發(fā)射熒光。這正是受激發(fā)射抑制（Stimulated Emission Depletion，STED）技術的構(gòu)想[8]。用高強度的紅外 STED 光同步照射被激發(fā)光斑照明的區(qū)域，被激發(fā)處于S1能級的熒光蛋白因為在 STED光的作用下受激輻射發(fā)出紅外光回到 S0能級的過程壓過了自發(fā)輻射發(fā)出熒光的過程而不能發(fā)出熒光。通過構(gòu)造 STED 光的空間分布可以使其構(gòu)成一個中空的分布，即中間部分不會誘發(fā)熒光蛋白受激輻射，中間仍發(fā)出熒光；外圍由于受激輻射的作用熒光發(fā)射被抑制。加大 STED 光的光強，其對熒光的抑制作用會進一步向中空區(qū)域收縮，最終導致只有超越衍射極限級別的球形區(qū)域才能發(fā)出熒光。另一種基于點掃描三維成像技術為雙光子激光掃描熒光顯微技術[9-10]。相比于單光子的線性激發(fā)

第一章 緒論處于基態(tài)的熒光蛋白需要連續(xù)（0.5 飛秒之內(nèi)）吸收兩個能量相同的光子實現(xiàn)躍遷，且兩個能級的能量差要剛好等于兩個光子的能量之和。之后熒光蛋白經(jīng)過非輻射的弛豫過程后自發(fā)輻射出一個熒光光子回到基態(tài)。若要觀察到該過程，需要用飛秒激光器發(fā)出的高功率紅外脈沖光激發(fā)熒光蛋白。


本文編號：3341310