光片熒光顯微成像技術憑借其優(yōu)異的三維成像能力、單細胞尺度分辨率、快速成像性能和更低光毒性和光漂白性等優(yōu)點,目前正被廣泛應用于生物醫(yī)學研究。隨著成像應用的深入,光片熒光顯微成像系統(tǒng)中存在的問題和不足也亟需研究和解決,包括系統(tǒng)移植性差、商業(yè)化光片成像系統(tǒng)價格昂貴、多通道同步光片熒光成像能力不足、樣品的操控較為復雜及分辨率和成像視野之間難以調和的矛盾等。本文圍繞光片熒光顯微成像技術中存在的上述問題進行了研究和優(yōu)化,設計得到了功能多、用途廣泛且與常規(guī)倒置熒光顯微系統(tǒng)兼容的小型化光片熒光顯微成像系統(tǒng),并通過實際的生物成像應用展示了該系統(tǒng)具有的先進技術和優(yōu)異性能。具體研究內(nèi)容包括:首先,基于光片熒光顯微成像原理,采用緊湊的照明光路設計及硬件集成化,提出并設計了兼容寬場倒置熒光顯微鏡的小型化光片熒光顯微成像系統(tǒng)。采用圖像分割光路設計,提出了雙通道同步光片熒光成像技術。根據(jù)柱面鏡光片生成原理,設計了改變?nèi)肷涔夂穸燃巴哥R焦距的照明光片厚度調節(jié)機制,滿足不同尺寸生物樣本的成像需求。活體斑馬魚胚胎三維熒光成像及心跳血流高速動態(tài)成像實驗表明,小型化光片熒光顯微系統(tǒng)能實現(xiàn)照明光片厚度可調,且在獲得高對比度圖像同時,軸向分辨率相比于常規(guī)寬場熒光顯微鏡有數(shù)十倍提升。然后,研究了基于小型化光片熒光顯微成像系統(tǒng)的三維體像素超分辨算法,推演了實際物理成像過程中的圖像退化模型,通過最大似然估計方法,建立了基于三維圖像堆棧序列亞像素位移信息的圖像超分辨重建數(shù)學模型。提出了空間斜軸掃描技術,發(fā)展并研究了分辨率增強光片熒光顯微成像系統(tǒng)。通過系統(tǒng)點擴散函數(shù)測量及斑馬魚和鼠腦樣本的超分辨對比成像實驗,驗證了三維超分辨成像系統(tǒng)能在實現(xiàn)4X/0.16低倍物鏡的成像視野同時,達到10X/0.4高倍物鏡的橫向分辨率且三維成像的軸向分辨率亦有2~3倍提升,以此實現(xiàn)大視野高分辨成像。最后,將微流控技術運用到光片熒光顯微成像技術中,提出了基于小型化光片熒光顯微成像系統(tǒng)的光流控三維成像技術。通過光流控三維成像技術原理分析,研究了樣品自掃描光片三維成像技術實現(xiàn)過程。闡述了光流控芯片制作流程,通過光學側面平整技術,減少了光信號散射,提高了系統(tǒng)光片成像性能,為光流控技術的應用提供了必要的技術支持。通過微液滴成像實驗,實現(xiàn)了微液滴體積尺寸及顆粒濃度的精確量化分析,驗證了光流控成像技術的三維成像能力。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：TH742.65
【部分圖文】：

1.1 研究背景與意義亙古至今，人們從來沒有停止過對微觀世界的認知。在這過程之中，顯微成像技術伴隨著人們對微觀世界的深入探索而不斷地發(fā)展。顯微意味著借助成像工具實現(xiàn)了僅憑靠人類肉眼無法實現(xiàn)的對微小事物的觀察。顯微鏡則是其中最為重要的工具之一。顯微鏡的出現(xiàn)，彌補了人們直接通過裸眼無法進一步觀察細微事物或者微觀結構的不足，開啟了人們對微觀世界研究的大門。顯微成像技術是伴隨著生命科學研究的深入而不斷發(fā)展的。從 17 世紀，虎克顯微鏡的發(fā)明，人類第一次看到了植物細胞的結構。到 20 世紀上半葉，相差顯微鏡的發(fā)明，使得觀察未經(jīng)染色的透明活細胞成為可能。而隨著熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)，以及生物熒光標記技術的發(fā)展，激光共聚焦顯微鏡應運而生。使用激光共聚焦顯微鏡，能夠實現(xiàn)對多細胞的組織進行三維的掃描、重構，從而追蹤細胞在真實三維空間中的演化和發(fā)展。而近十年來，尖端的光片熒光顯微成像技術的出現(xiàn)，又將三維顯微成像技術向更高的時間和空間分辨率作了極大的推進。

科 技 大 學 博 士 學 位 論 和信號的采集方式發(fā)生了極大的變化，因此不斷推動[2-6]。尤其隨著新型的生物熒光染料和轉基因熒光標記熒光顯微成像技術應運而生。熒光顯微成像作為對微細胞事件的強有力觀察手段，從誕生以來一直是現(xiàn)代技術。隨著熒光顯微成像技術在生命科學研究中的的新紀元[7]。

圖 1-3 基于光片熒光成像的三維腫瘤細胞團：(a)最大值投影三維細胞團圖像；(b)細胞團截面圖像[12]在發(fā)育生物學中，對生物器官組織乃至全胚胎的研究也在逐步向三維空間發(fā)展。雖然平面二維圖像能在一定程度上滿足科研者們對細胞形態(tài)、體內(nèi)器官組織結構及全胚胎發(fā)育情況研究的需要。但是通過單一的平面投影圖像能得到的信息往往是很有限的。在實際的生命個體中，其器官組織具有三維形態(tài)，體內(nèi)結構細胞的生長發(fā)育形態(tài)也具有空間性。除此之外，實現(xiàn)生命機能的功能細胞分布于各個器官組織中，因此其分布同樣具有空間性。在對樣本進行更準確和嚴謹?shù)陌l(fā)育生物學研究時，研究者們往往需要在真實三維形態(tài)下對樣本進行更加精細的統(tǒng)計分析。例如通過對胚胎的三維成像，Irene Wacker 等人實現(xiàn)了對斑馬魚全胚胎中所有免疫細胞的定量分類統(tǒng)計，并在三維的免疫突觸統(tǒng)計分析結果中，研究了胸腺細胞和腎髓細胞在與癌細胞聯(lián)合培養(yǎng)時的細胞毒性反應[18]。在 2008 年，Philipp J. Keller 等人通過對早期斑馬魚胚胎發(fā)育過

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