【摘要】：光學(xué)顯微鏡,作為科學(xué)研究觀察的重要工具,被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、以及材料科學(xué)等領(lǐng)域中。但是,因?yàn)?873年被提出的阿貝衍射極限的存在,如何獲得更高的分辨率一直困擾物理學(xué)家們。在衍射極限被提出后的近一個(gè)世紀(jì)內(nèi),科學(xué)界普遍認(rèn)為衍射極限就是光學(xué)分辨率極限。這里,分辨率極限可以通過一個(gè)模型來代表,被測樣品可以當(dāng)作是一個(gè)由不同周期組成的光柵的集合,可以通過收集物鏡的最高空間頻率可以用Kc= 2πNA/λ表示,Kc慫代表了光學(xué)傳遞函數(shù)的截止頻率。這種情況使得光學(xué)分辨率被局限在二分之一的波長,在1968年,作為第一個(gè)光學(xué)超分辨顯微方法,共聚焦顯微鏡被提出來去繞過衍射極限的限制。共聚焦顯微鏡的背后機(jī)理是空間上輻射點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)和搜集點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的乘積(頻率域上對應(yīng)的是二者傅里葉變換的乘積),這使得對應(yīng)系統(tǒng)的有效OTF被拓寬到超越寬場的極限。這個(gè)突破也潛在于一個(gè)本質(zhì),那就是衍射極限不僅影響著探測PSF,同時(shí)還影響著照明PSF。同時(shí),照明PSF在激發(fā)樣品上熒光時(shí),又把自己的空間頻率轉(zhuǎn)化到樣品頻率上,這也是其他超分辨顯微方法的基礎(chǔ),雖然沒有真正的去打破衍射極限,但是通過控制照明-激發(fā)-輻射的來產(chǎn)生非線性激發(fā),很好地達(dá)到了超分辨。因此,通過照明調(diào)制來調(diào)控激發(fā)圖樣,獲得更高的空間頻率。對于空間高頻分量進(jìn)行解調(diào),獲得超分辨信息。這兩步是本文的重點(diǎn)。學(xué)位論文結(jié)構(gòu)如下:1.介紹超分辨的歷史,應(yīng)用場景現(xiàn)在主要面臨著特殊熒光標(biāo)記、圖像采集時(shí)間長、分辨率高的問題。對于這些問題從成像過程和頻域角度給予總結(jié)性評價(jià)。并且給出若干可行的解決方法。2.第二章,提出基于熒光輻射差分顯微方法的改進(jìn)。在這個(gè)章節(jié)內(nèi)提出了I,可以實(shí)現(xiàn)三維超分辨的3D-FEl)超分辨方法;II,通過熒光飽和效應(yīng)同時(shí)實(shí)現(xiàn)分辨率提高和畸變減小的飽和FED超分辨方法遠(yuǎn)場熒光顯微鏡在很長的一段時(shí)內(nèi)一直受限于阿貝衍射極限。因此,它在納米級應(yīng)用中的表現(xiàn)一直不盡人意。盡管電鏡技術(shù)可以提高分辨,但他們并不能被直接應(yīng)用干觀察活細(xì)胞并且也沒有打破衍射極限。在已經(jīng)提出來的超分辨顯微方法中,熒光輻射差分顯eu術(shù)利用了相減方法去探究超分辨,他也可以被利用于去觀察一些生物樣品同時(shí)下需要特殊熒光染料的需求。雖然FED的分辨能力比STED要差不少,但是因?yàn)樗闹苯有?簡便性有著可以廣泛應(yīng)用的前景。先前關(guān)于這方面應(yīng)用有二次諧波FED,雙光子FED,以及相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微鏡。此外,相對于其他不需要樣品受限的方法,FED需要更少的采集時(shí)間以及后處理,相對于結(jié)構(gòu)光照明顯微方法。但是,先前的FED在相減過程中有著畸變和信息N失的風(fēng)險(xiǎn)。特別是相減系數(shù)增加的時(shí)候,會(huì)有明顯的負(fù)值。并且FED的分辨率也受限于空心光斑中心半徑的大小。這種負(fù)值帶來的負(fù)面影響在對密集樣品成像時(shí)會(huì)更加明顯。我們通常將負(fù)值歸零的方法會(huì)把很多有用信號給抹去。在之前的探索中,榮等人使用過柱狀矢量光FED去獲得一個(gè)中心縮小的空心以及橫向擴(kuò)大的是實(shí)心光斑。雖然先前的方法從一定程度上減小畸變,但是程度依然不夠用于在密集樣品成像。另外在先前方法中空心光斑的中心依然很大,影響了最終的分辨率提高。在此章中我們利用了飽和非線性效應(yīng)去產(chǎn)生兩種激發(fā)光,一種是中心縮小的空心光斑,一種是邊緣擴(kuò)大的實(shí)心光斑。利用這兩種光斑進(jìn)行相減,可以一方面減小負(fù)值,也可以另一方面去通過縮小中心的空心斑來增加分辨率。在這里我們利用對于羅丹明6G的樣品仿真來進(jìn)行初步證明。同時(shí)實(shí)驗(yàn)上我們也對生物樣品或者納米顆粒去證明。在4Onm熒光顆粒的成像結(jié)果得到108 nm的分辨率。通過對于微管的超分辨成像中我們獲得了 175nm的分辨率。在此章的另一部分,我們利用了一個(gè)相位型空間光調(diào)制器來產(chǎn)生軸向和橫向的空心光斑。利用實(shí)心光斑產(chǎn)生的圖像與這兩者圖像進(jìn)行相減,我們得到了 3D的超分辨結(jié)果。3.第三章,提出了基于飽和吸收競爭的超分辨顯微方法,也在這章中首次在實(shí)驗(yàn)和方針上驗(yàn)證了此類超分辨方法的可行性。在開發(fā)超分辨顯微鏡時(shí)候,飽和效應(yīng)被去廣泛用于產(chǎn)生熒光激發(fā)和輻射之間的非線性效應(yīng)。飽和激發(fā)顯微鏡(SAX)利用一個(gè)非線性響應(yīng)去激發(fā)在激發(fā)態(tài)的熒光分子去提出高頻分量,從而去獲得物理超越衍射極限外的結(jié)構(gòu)信息。STED以及其他可你飽和轉(zhuǎn)換顯微方法,則利用受激輻射去抑制自發(fā)輻射以及去進(jìn)一步通過飽和效應(yīng)去抑制。目前最好的STED效果達(dá)到2.4 nm的分辨額能力。因?yàn)镾TED可以獲得納米級的分辨率,它目前被更廣泛地使用和探索。在STED)過程中,一個(gè)高波長耗盡空心光斑將光子轉(zhuǎn)換到暗態(tài),此時(shí)產(chǎn)生的受激輻射和自發(fā)輻射之間的競爭得到一個(gè)衍射極限的PSF。在這里我們把這步驟稱之為后競爭因?yàn)樗a(chǎn)生在熒光激發(fā)的過程中。對應(yīng)的另外一種前置競爭是基態(tài)耗盡方法(GSD)。在GSD,熒光是被通過轉(zhuǎn)換到T1態(tài)來實(shí)現(xiàn)開關(guān)。此外,還有其他兩種超分辨方法利用了飽和吸收。Wang等人引入了笫三束光到pump-probe過程來實(shí)現(xiàn)非熒光吸收過程的飽和。雖然也同時(shí)帶來了更復(fù)雜和昂貴的系統(tǒng)。Yang等人利用了飽和激發(fā)過程并利用共振從中提出重疊的熒光。但他們的方法需要去在液態(tài)氦來冷卻以及恃殊的熒光分子。這種特殊的限制使得他們很難被應(yīng)用于實(shí)際觀測,比如生物成像。因此,證明一種超分辨的,利用單束連續(xù)光在光吸收飽和下的競爭,在室溫環(huán)境下能夠使用方法迫在眉睫。在此章,我們提出了一種前置競爭方法,利用了兩束入射光在吸收態(tài)下的競爭去開發(fā)飽和競爭過程并且利用了鎖相零差解調(diào)方法去分離出混疊的熒光信號。同時(shí)實(shí)驗(yàn)上用80nm大小的細(xì)胞核孔復(fù)合物以及熒光顆粒證明了 100 nm也就是1/6波長的空間分辨率。在此章中,我們還相信討論了熒光漂白情況,實(shí)驗(yàn)的具體細(xì)節(jié)以及此章出方法和結(jié)構(gòu)光成像(SIM)的對比。4.第四章,提出并驗(yàn)證了非線性焦斑調(diào)制的超分辨顯微方法。在這章我們報(bào)道了非線性焦斑調(diào)制顯微方法來應(yīng)用于超分辨成像。存過去20年,我們看到很多坐標(biāo)固定超分辨方法(對應(yīng)于STORM、PAl,M等坐標(biāo)隨機(jī)超分辨方法)。他們幾乎都是通過控制照明光束從而調(diào)制出想要的,以及更具有信息量的光學(xué)圖案。對應(yīng)的照明光學(xué)圖案可以被歸類為結(jié)構(gòu)光或者點(diǎn)照明。他們被廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡和共聚焦顯微鏡中。因?yàn)楦吖鈴?qiáng)對于超過兩倍的分辨率提高很有用,STED和SSIM這類利用飽和非線性的去縮小高斯輻射光斑大小的方法。由STED證明聚焦照明是一個(gè)很好地去實(shí)現(xiàn)高光強(qiáng)飽和的方式并且在深度成像中能夠保持較高的光強(qiáng)是主要原因。雖然避免了像SSIM那樣需要一大堆采集圖像,STED依然有著諸如不能夠完全耗盡,對于多色樣品或者長激發(fā)光譜樣品不夠靈活的問題。其中,高波長高功率的耗盡光帶來的再激發(fā)是重要問題。雖然在近來有方法通過引入額外的空心光的圖案進(jìn)行相減的方法減輕再激發(fā)問題,或者精致地去選擇熒光染料的方法去減輕,但是帶來更大的系統(tǒng)復(fù)雜度。另外,由于極度依賴兩束光斑的對準(zhǔn)以及空心斑中心的完美程度,STED在深度成像中受到相差等的限制,最后,STED和SSTM都需要一 高光強(qiáng)的光源和復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng),限制了他們?nèi)ケ桓鼜V泛的應(yīng)用。近來,幾個(gè)研究組利用了基于結(jié)構(gòu)光的算法來后處理圖像掃描顯微鏡(ISM)以圖能夠在線性或者非線性激發(fā)的情況下得到額外的收獲。但是,在他們的系統(tǒng)中他們利用的一個(gè)高斯照明圖案非常限制了他們的分辨率的提高,尤其在飽和的情況下。在此章我們通過去尋找一個(gè)可行的并且靈活的,繼承之前共聚焦系統(tǒng)方法去突破兩倍的分辨率。換句話說,我們問一個(gè)問題,給定一個(gè)聚焦照明情況下并且限定參數(shù),什么樣的激發(fā)方案能夠帶來一個(gè)物體的空間結(jié)構(gòu)信息并同時(shí)能夠很容易去實(shí)施。當(dāng)我們回復(fù)過去的點(diǎn)掃描超分辨方法,我總結(jié)過去的方法都是在達(dá)到一個(gè)目的,那就是通過各種方法不斷去縮小激發(fā)的PSF。比如通過貝塞爾光束,超振,偏振調(diào)制或者減小小孔大小,通過散射介質(zhì)成像等方法去縮小或者是簡潔的通過去剝?nèi)ゼぐl(fā)PSF的光斑來達(dá)成。但是,當(dāng)我們考慮移頻原理,我們發(fā)現(xiàn)超分辨方法不一定需要去讓PSF足夠小來告訴我們物體的具體位置而是,去不斷擴(kuò)大整個(gè)系統(tǒng)痛輻射圖案的頻率覆蓋來達(dá)到超分辨。因此,在這章中我們強(qiáng)調(diào)移頻作為點(diǎn)掃描照明顯微中一個(gè)根本的機(jī)理并且引入了非線性焦點(diǎn)調(diào)制(NFOMM)顯微方法,作為利用高光強(qiáng)調(diào)制光斑掃描的顯微方法。在NFOMM中,我們通過合理的照明光場調(diào)控(飽和激發(fā)通過高強(qiáng)度照明和頻率移動(dòng)的照明PSF通過相位調(diào)制),顯著的物體高頻信息被通過非線性激發(fā)來保留下來。當(dāng)移動(dòng)物理高頻信息過程結(jié)束后,我們利用系統(tǒng)的前向模型后處理這些采集圖像最終得到超分辨圖像。在此章中,我們驗(yàn)證了 NFOMM能夠達(dá)到60nm也就是十分之一波長的分辨率。我們也驗(yàn)證了 NFOMM的雙色成像能力并用細(xì)胞核孔證明了 NFOMM有著不亞于STED的成像分辨能力。因?yàn)镹FOMM可以應(yīng)用于普通共聚焦系統(tǒng)時(shí)只需要額外引入一個(gè)空間光調(diào)制器并且非常容易去對準(zhǔn),我們期望它能夠被迅速廣泛應(yīng)用,從而幫助生物觀測。5.第五章,提出并驗(yàn)證了利用結(jié)構(gòu)光照明提高SOFI分辨率的方法。通過分析閃爍體的隨機(jī)時(shí)空漲落,SOFl得到了超分辨信息同時(shí)比之于定位超分辨方法(比如STORM和PALM)限制更少,更適用于低信噪比的情況。但是,由于S0FI先前的分辨率受限于累計(jì)幾次的平方根關(guān)系,分辨率提高不足因此限制它向很多高分辨觀察的廣泛引用。在此章,我們拋棄了默認(rèn)的在隨機(jī)成像中的平場照明,轉(zhuǎn)而引入結(jié)構(gòu)光照明(比如高斯或者正弦條紋)到SOFl;成像中去很大程度上提高分辨率。通過根據(jù)采集中的實(shí)際參數(shù)和顯微鏡的特性,我們驗(yàn)證了結(jié)構(gòu)光SOFI的原理并且僅用二階累積就實(shí)現(xiàn)了4-6倍的分辨率提高。作為參照,之前二階累積只能實(shí)現(xiàn)(?)2倍的分辨率提升。在這章,我們也給出了結(jié)構(gòu)光S0F1用于實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)的重建方法。利用結(jié)構(gòu)光照明的SOF1成像在空間分辨率上能夠輕易達(dá)到40-60nm。在之后的應(yīng)用中我們期望它能和STORM等中心定位方法產(chǎn)生互補(bǔ)。從而帶來更好,更全面的分辨率提升選擇。6.對于文中所做工作的總結(jié)、展望。目前超分辨方法種類繁多,但是實(shí)際上有效可用的非常少。從速率分辨率兩個(gè)角度來說,STED是最可行的方法。但STED在具體應(yīng)用葉中受限很大。在此文中,我利用熒光飽和效應(yīng),提出了幾種更直接,便捷的方法。其中在第四章中的NF0MM方法最為簡潔,且分辨能力優(yōu)異,具有在材料成像,多色成像中取代STED成像的優(yōu)點(diǎn)。我期待這些技術(shù)以后能被更多地應(yīng)用于生物觀測中。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TP391.41;TH742

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