【摘要】：生物熒光顯微鏡使用特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射生物組織中的特定對(duì)象,使其標(biāo)記的熒光物質(zhì)發(fā)射熒光,進(jìn)行結(jié)構(gòu)性和功能性成像。在傳統(tǒng)生物熒光顯微鏡中,整個(gè)生物組織的三維范圍都被照射,位于焦平面以外的樣本也會(huì)發(fā)射熒光,一方面影響成像的對(duì)比度和分辨率,另一方面會(huì)顯著增加光漂白效應(yīng),使得系統(tǒng)可以連續(xù)成像的時(shí)間大大縮短。另外,傳統(tǒng)生物熒光顯微鏡的照明光是可見光波段的連續(xù)激光,這種激光在生物組織中的傳播過(guò)程中受到嚴(yán)重的吸收和散射,導(dǎo)致穿透深度很小,難以滿足成像需求。為了解決傳統(tǒng)生物熒光顯微鏡存在的以上問(wèn)題,雙光子光片顯微鏡應(yīng)運(yùn)而生。雙光子光片顯微鏡將照明光由可見光波段的連續(xù)激光改為近紅外波段的飛秒脈沖激光,近紅外照明光受生物組織的吸收和散射影響小,使得照明深度增加。照明光在生物組織中聚焦并激發(fā)出雙光子熒光,激發(fā)出的雙光子熒光被局限在照明光焦點(diǎn)處而且比照明光焦點(diǎn)區(qū)域還要小,焦點(diǎn)以外的熒光不會(huì)被額外激發(fā),在此基礎(chǔ)上,通過(guò)掃描器件對(duì)照明光沿橫向和照明深度方向進(jìn)行快速掃描,即可在生物組織處產(chǎn)生雙光子光片。因此,雙光子光片顯微鏡的空間分辨率高,光漂白效應(yīng)很低,逐漸成為活體組織成像的利器。隨著腦神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展,生物醫(yī)學(xué)研究人員對(duì)雙光子光片顯微鏡的性能提出了更加全面的要求,系統(tǒng)需要在保持高分辨率、低光漂白效應(yīng)的基礎(chǔ)上達(dá)到600μm×600μm的成像視場(chǎng)。雙光子光片顯微鏡在橫向上的掃描由掃描振鏡完成,通過(guò)設(shè)置其參數(shù)可以實(shí)現(xiàn)600μm的掃描范圍;軸向(照明深度方向)上的掃描是通過(guò)超高速變焦透鏡(TAG變焦透鏡)對(duì)照明光光焦度的調(diào)節(jié)來(lái)完成,這種方式雖然能夠?qū)崿F(xiàn)雙光子焦點(diǎn)的軸向移動(dòng),但是無(wú)法達(dá)到600μm的穿透深度。另外,由于活體生物組織是非均勻的光學(xué)介質(zhì),照明光傳播至生物組織深處時(shí)會(huì)受到隨機(jī)像差的影響而發(fā)生波前畸變,導(dǎo)致照明光穿透深度減小,嚴(yán)重減小了雙光子光片的有效范圍。因此,目前雙光子光片顯微鏡的最大成像視場(chǎng)局限在170μm×170μm的范圍內(nèi),難以滿足全腦神經(jīng)組織的成像需求。針對(duì)以上問(wèn)題,本論文將自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)應(yīng)用于雙光子光片顯微鏡的照明光路中,展開以下研究?jī)?nèi)容:利用MATLAB對(duì)雙光子光片的產(chǎn)生過(guò)程進(jìn)行模擬,分析了不同像差對(duì)雙光子光片厚度和強(qiáng)度產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明,系統(tǒng)需要探測(cè)和校正的Zernike項(xiàng)數(shù)應(yīng)不多于58項(xiàng),為自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供了基本依據(jù)。由于TAG變焦透鏡無(wú)法實(shí)現(xiàn)軸向600μm穿透深度的調(diào)節(jié),因此,提出雙側(cè)照明的光路結(jié)構(gòu),使得單側(cè)照明深度要求從600μm降為300μm。但是,TAG變焦透鏡仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)單側(cè)300μm的照明深度,為此,提出利用液晶波前校正器(LCOS)輔助調(diào)焦的分區(qū)域照明方法:利用LCOS加載離焦像差實(shí)現(xiàn)雙光子光片在照明深度方向上的移動(dòng),形成不同深度處的雙光子光片子區(qū)域,不同子區(qū)域拼接配合成像相機(jī)的長(zhǎng)時(shí)間曝光實(shí)現(xiàn)雙光子光片在照明深度方向上的擴(kuò)展,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)成像視場(chǎng)的擴(kuò)展。分區(qū)域照明的方法一方面擴(kuò)展了照明深度,另一方面使得超高速掃描條件下的自適應(yīng)波前校正和波前探測(cè)成為可能。由于TAG變焦透鏡的工作頻率高達(dá)200kHz~400kHz,而波前探測(cè)器和波前校正器的工作頻率只有1kHz左右,工作頻率上的巨大差異使得波前探測(cè)和波前校正難以實(shí)現(xiàn)。為此,在分區(qū)域照明方法的基礎(chǔ)上,基于等暈區(qū)的概念,提出利用同一個(gè)LCOS并行完成視場(chǎng)擴(kuò)展和分等暈區(qū)像差校正的方法:將單側(cè)照明視場(chǎng)分為18個(gè)等暈區(qū),每個(gè)等暈區(qū)大小為100μm×100μm,等暈區(qū)在橫向上的調(diào)節(jié)由掃描振鏡完成,在軸向上的調(diào)節(jié)由LCOS加載離焦像差完成,在此基礎(chǔ)上,等暈區(qū)內(nèi)的掃描由掃描振鏡和TAG變焦透鏡完成,等暈區(qū)內(nèi)的像差校正由LCOS完成,實(shí)現(xiàn)600μm×300μm范圍內(nèi)的掃描和校正需要的時(shí)間為36ms。對(duì)LCOS并行完成視場(chǎng)擴(kuò)展和像差校正進(jìn)行理論分析,得出LCOS像素?cái)?shù)為512×512時(shí)即可滿足300μm的軸向視場(chǎng)擴(kuò)展和RMS=1.0λ的生物組織像差校正的需求。同時(shí),提出在照明光路中應(yīng)用雙光子焦點(diǎn)作為探測(cè)信標(biāo)配合解掃描技術(shù)的波前探測(cè)方法,將同一等暈區(qū)范圍內(nèi)的熒光信號(hào)進(jìn)行解掃描疊加,實(shí)現(xiàn)探測(cè)信噪比的增強(qiáng)。如此一來(lái),雖然掃描速度高達(dá)200kHz~400kHz,但是無(wú)需進(jìn)行逐點(diǎn)的像差探測(cè)和校正,只需要在等暈區(qū)范圍內(nèi)進(jìn)行一次探測(cè)和校正即可,大大降低了波前探測(cè)和波前校正的時(shí)間頻率,使得波前探測(cè)器和波前校正器能夠在超高速掃描條件下實(shí)現(xiàn)像差的探測(cè)和校正。對(duì)波前探測(cè)和波前校正進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)波前探測(cè)仍然無(wú)法完成,因?yàn)檎彰鞴饴份S向掃描是通過(guò)調(diào)節(jié)光焦度實(shí)現(xiàn)的,而軸向不同位置的光進(jìn)入哈特曼波前探測(cè)器時(shí)也會(huì)產(chǎn)生不同的離焦像差,使得波前探測(cè)發(fā)生混亂。因此,必須對(duì)波前探測(cè)時(shí)的軸向掃描方式進(jìn)行改進(jìn)。由于生物組織中像差的時(shí)間變化頻率很低,變化周期以分鐘或小時(shí)為單位,因此,將波前探測(cè)和波前校正分離,提出先探測(cè)像差、再存儲(chǔ)像差、后校正像差的時(shí)序控制方法。像差探測(cè)時(shí),關(guān)閉LCOS和TAG變焦透鏡,利用壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器(PZT)帶動(dòng)照明物鏡進(jìn)行焦點(diǎn)的軸向掃描,以100μm×100μm的等暈區(qū)為單位進(jìn)行解掃描波前探測(cè),整個(gè)視場(chǎng)內(nèi)的像差探測(cè)完成后再利用LCOS和TAG變焦透鏡進(jìn)行軸向掃描和校正成像。由此程序完成600μm×300μm視場(chǎng)的像差探測(cè)需要約200ms,仍然遠(yuǎn)小于生物組織中像差的變化周期,能夠保證在像差不變的情況下完成后續(xù)的波前校正�；谝陨涎芯�,設(shè)計(jì)了雙光子光片顯微鏡的液晶自適應(yīng)光學(xué)成像系統(tǒng),完成了系統(tǒng)光學(xué)設(shè)計(jì)和優(yōu)化�；谙到y(tǒng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、便攜等因素的考慮,對(duì)系統(tǒng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的系統(tǒng)集成在750mm×650mm大小的平臺(tái)上。最后,搭建了整套雙光子光片顯微鏡的液晶自適應(yīng)光學(xué)成像系統(tǒng),并利用搭建的系統(tǒng)進(jìn)行自適應(yīng)探測(cè)和校正成像的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。制備了若丹明6G熒光染料染色的斑馬魚活體胚胎樣本,實(shí)現(xiàn)了照明光路軸向300μm深度的雙光子光片視場(chǎng)拼接和像差校正,實(shí)現(xiàn)了斑馬魚組織的液晶自適應(yīng)光學(xué)校正成像,校正前后的成像分辨率和信噪比得到了顯著提升。本論文屬于液晶自適應(yīng)光學(xué)在雙光子光片顯微鏡中應(yīng)用的開創(chuàng)性工作,通過(guò)對(duì)生物組織中隨機(jī)像差的探測(cè)和校正形成兼具高時(shí)空分辨率、大成像視場(chǎng)、大成像深度、低光漂白的顯微成像系統(tǒng),使得活體生物組織的長(zhǎng)時(shí)間大視場(chǎng)高分辨率成像成為可能。
【圖文】：

圖 1.1 光片顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1.1 Structural sketch of light-sheet microscopy，隨著光片顯微鏡的廣泛應(yīng)用，其性能上的局限性也逐漸突顯間分辨率受光片的厚度（2～8μm）所限制[11]，當(dāng)要實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)辨率由于強(qiáng)烈的散射和吸收作用而不斷下降，使得系統(tǒng)僅僅能無(wú)法觀察到 1μm 左右大小的神經(jīng)元樹突棘和線粒體等細(xì)胞器值孔徑的共聚焦或是雙光子顯微鏡。另外，成像深度受到單光絕大多數(shù)情況下都少于 200 微米，且分辨率會(huì)隨著成像深度的以上問(wèn)題，雙光子激發(fā)效應(yīng)被應(yīng)用于光片顯微鏡的照明光路，光片顯微鏡。光的照射下，基態(tài)熒光分子或原子吸收一個(gè)光子后成為激發(fā)

(a) (b)圖 1.2 熒光激發(fā)原理圖：（a）單光子激發(fā)；（b）雙光子激發(fā)re 1.2 Schematic diagram of fluorescence excitation: (a) one-photon excitation; (bphoton excitation光物質(zhì)的吸收截面 的大小反應(yīng)了其吸收光子的本領(lǐng)。一般說(shuō)來(lái)，收截面為 10-18~10-17cm2.s/photon，，而雙光子的吸收截面為 1.s/photon[13]。因此單光子吸收對(duì)光密度要求較小，即使弱光也可能發(fā)子吸收只有在光強(qiáng)足夠大的地方才可能發(fā)生。因?yàn)殡p光子的吸收截且要在 10-15s 內(nèi)吸收兩個(gè)光子，要產(chǎn)生有效的雙光子激發(fā)，在焦點(diǎn)當(dāng)高。為了不損傷細(xì)胞，雙光子激發(fā)要使用具有很高峰值能量和很飛秒脈沖鎖模激光器[16]。 1.3 為單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光的對(duì)比，與單光子激發(fā)相
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TH742

【參考文獻(xiàn)】

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2 程少園;曹召良;胡立發(fā);穆全全;李鵬飛;宣麗;;用夏克-哈特曼探測(cè)器測(cè)量人眼波前像差[J];光學(xué)精密工程;2010年05期

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本文編號(hào)：2706620