【摘要】：非線性顯微成像是利用光源與成像樣品之間的非線性作用,進而產(chǎn)生信號光來成像,這種成像方式將信號光的激發(fā)限制在聚焦焦點附近,排除了其他位置雜散光的影響,能顯著提升成像分辨率。而雙光子顯微成像作為其中最廣泛的一種非線性成像方式,應(yīng)用于醫(yī)療診斷,生物研究等多個領(lǐng)域,隨著GFP熒光蛋白多種變體的出現(xiàn),適用于這些熒光標(biāo)記物的920nm波段雙光子成像研究尤為重要。傳統(tǒng)的雙光子非線性成像過程中,由于激發(fā)光路和探測光路同軸,容易受到光漂白和光毒性等不良影響,并且點掃描三維成像的方式導(dǎo)致其成像速度較慢,不容易捕捉快速變化的圖像。將光片照明和雙光子成像結(jié)合,能減小光漂白光毒性,且成像速度極大提升。光片成像過程中為保證高成像速度,往往軸向分辨率過低,本系統(tǒng)加入點探測成像以獲取軸向高分辨率圖像。除此之外,高斯光照明的光片具有視場不均勻的問題,本系統(tǒng)引入貝塞爾光照明,使成像視場均勻。多種模態(tài)成像方式的結(jié)合使系統(tǒng)具有高分辨,高成像速度的,視場均勻的特點。系統(tǒng)方面,本文搭建了920nm多模態(tài)雙光子非線性成像系統(tǒng)。照明光路利用920nm波段的飛秒脈沖激光器作為光源,結(jié)合空間光調(diào)制器可以實現(xiàn)高斯光和貝塞爾光兩種照明方式,使用兩個方向的振鏡實現(xiàn)掃描。探測光路具有光片和點探測兩個模式,對于光片探測模式,x振鏡實現(xiàn)光片照明,z振鏡結(jié)合高速變焦透鏡進行軸向掃描,最終實現(xiàn)三維掃描。對于點探測模式,兩振鏡實現(xiàn)x-z視場的二維掃描,設(shè)計了兩個振鏡與點探測之間的時序關(guān)系,以獲得準(zhǔn)確的二維圖像。實驗方面,首先利用該系統(tǒng)進行熒光微球成像,以測試系統(tǒng)的視場和分辨率,根據(jù)成像結(jié)果得到成像視場為770μm×770μm×324μm,光片模式的橫向分辨率為0.767μm,軸向分辨率為5.83μm,而點探測模式的分辨率為2.12μm。然后對EGFP標(biāo)記血的斑馬魚血管成像,驗證了本系統(tǒng)高分辨成像的能力;對斑馬魚心臟成像驗證了系統(tǒng)高速成像能力。最后驗證使用空間光調(diào)制器擴展光片視場的均勻性,結(jié)果表明貝塞爾光照明將原本集中在視場中心的熒光激發(fā)均勻擴展到整個成像視場。
【圖文】：

微成像技術(shù)微鏡不同，共聚焦顯微成像系統(tǒng)中，將一個精，進行空間濾波，濾除焦點以外的光，結(jié)合機著提升成像的分辨率。這種成像方式有效改善，非焦點的熒光激發(fā)帶來的分辨率下降問題。面處的熒光激發(fā)，使用深度方向的掃描元件成像系統(tǒng)具有了三維層析能力。三維成像可以響，從而便于研究人員的研究，在生命科學(xué)以像技術(shù)的原理圖如圖 1-1，點光源，樣品上的于共軛位置。光源的光通過物鏡聚焦到樣品上發(fā)射出的信號光沿著不同路徑前往探測器方向平面發(fā)出的光能被探測器接受。通過掃描元件行逐點成像，最終得到高分辨率的圖像。

第一章 緒論成像的有效深度最大概在 200μm 左右，無法對樣品深層進行有效成像[4]。1.1.3 非線性顯微成像技術(shù)傳統(tǒng)的單光子熒光成像過程中，一個熒光分子吸收一個激發(fā)光的光子，釋放一個波長更長的熒光光子，熒光的激發(fā)概率和激發(fā)光的強度成正比，是一個線性程。非線性顯微成像是利用光源與成像樣品之間的非線性作用，進而產(chǎn)生信號來像，單個分子或原子基團同時吸收多個光子激發(fā)出一個新的光子。該過程中，熒的激發(fā)概率與激發(fā)光強度的高次方成正比，而不是單光子成像中的線性關(guān)系。非性成像對激發(fā)光能量密度具有高需求，將成像信號光的激發(fā)限制在聚焦焦點附近非線性成像相較于共聚焦成像天然具有焦點處的“針孔”，排除了其他位置雜散的影響，顯著提升成像的分辨率。如圖 1-2(a)所示為幾種成像方式的原理圖，圖 2(b)和 1-2(c)為線性成像和非線性成像的激發(fā)效果對比，可以看到非線性成像時激發(fā)光集中在焦點附近，，而線性激發(fā)區(qū)域則較大。
【學(xué)位授予單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TP391.41;TH742

【參考文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 宗偉健;微型雙光子顯微鏡及自由活動小鼠神經(jīng)成像[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2017年

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1 李茜;飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2014年

2 王盛滿;雙光子熒光顯微鏡的研究[D];浙江大學(xué);2006年

本文編號：2638968