本文關(guān)鍵詞：扁桃酸代謝對(duì)隱球菌毒力作用的探討及頭癖常見(jiàn)病原菌的快速分子鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：選題背景隱球菌病是臨床上最常見(jiàn)的侵襲性真菌病之一,在全球范圍內(nèi)存在很高的發(fā)病率和致死率。隨著科學(xué)研究的進(jìn)一步深入,目前隱球菌已經(jīng)作為一種模式真菌廣泛的應(yīng)用于致病機(jī)制、毒力因子、臨床藥敏、分子遺傳學(xué)及生理特性等方面的研究。目前研究較為透徹的毒力因子主要包括：隱球菌莢膜、黑色素的分泌、高溫高滲生長(zhǎng)及尿素酶的產(chǎn)生等。通過(guò)前期研究“新生隱球菌減數(shù)分裂基因ISC10的生理功能”中發(fā)現(xiàn),減數(shù)分裂基因ISC1O突變株的毒力明顯降低,在肺部和腦部的荷菌量減少的同時(shí),通過(guò)基因芯片分析基因組學(xué)變化發(fā)現(xiàn)引起了酪氨酸代謝相關(guān)調(diào)控的改變,尤其是扁桃酸代謝相關(guān)蛋白基因表達(dá)的上調(diào),使得扁桃酸鹽產(chǎn)生增加。然而,扁桃酸及其代謝在真菌方面目前尚未有所研究,主要局限在抗寄生蟲(chóng)、抗陰道滴蟲(chóng)及工業(yè)化學(xué)光學(xué)異構(gòu)性的合成方面,而扁桃酸衍生物作為臨床醫(yī)藥的重要中間體,參與介導(dǎo)心血管系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)感染等。由此我們?cè)噲D初步探討研究扁桃酸及其代謝對(duì)于隱球菌毒力方面發(fā)揮的作用,為篩選隱球菌新的毒力因子及后期尋找新的臨床治療靶點(diǎn)提供新的依據(jù)。頭癬是我國(guó)常見(jiàn)的淺部真菌病,主要累及兒童,具有很強(qiáng)的傳染性及傳播性。在世界范圍內(nèi),其致病菌呈現(xiàn)出明顯的地域性差異。而在我國(guó),尤其在新疆西部地區(qū)多以紫色毛癬菌為主,而大陸的其他地區(qū)則為表現(xiàn)為犬小孢子菌。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展,衛(wèi)生體制改革的進(jìn)一步深化,人們的生活水平在不斷提高,衛(wèi)生觀念意識(shí)得到了不斷地加強(qiáng),我國(guó)大陸東南部地區(qū)頭癬的發(fā)病率明顯降低,多表現(xiàn)為散發(fā)。但在新疆地區(qū),一直以來(lái),病例仍居高不下。因此,我們希望能夠從整體水平上將各個(gè)中心相關(guān)報(bào)道進(jìn)行匯總,并進(jìn)一步分析、總結(jié)我國(guó)近年來(lái)頭癬的發(fā)病情況,從而掌握主要致病菌及其流行病學(xué)特點(diǎn)則更具有深遠(yuǎn)的意義。在臨床病原菌的診斷方面,傳統(tǒng)大多采用直接鏡檢法、菌種培養(yǎng)法及生理生化法等。往往存在耗時(shí)長(zhǎng),主觀依賴性較強(qiáng),易誤診,影響因素較多,易污染等問(wèn)題；隨著PCR等分子生物學(xué)手段的推廣,結(jié)合一、二代測(cè)序,大大提高了診斷的準(zhǔn)確性,但是操作需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)支持,存在嚴(yán)格的條件的局限性,難以在臨床上得到普遍的推廣與應(yīng)用。同時(shí)鑒于皮膚癬菌菌落表型多樣性和遺傳進(jìn)化的相近性,利用常規(guī)ITS PCR法難以將其鑒定區(qū)分至種。因而,在臨床上,尋求一種新的簡(jiǎn)單、便捷,且具有高度敏感性和特異性的檢測(cè)方法,不僅對(duì)早期的疾病診治及預(yù)后都具有重大的現(xiàn)實(shí)意義,而且為其他病原菌及相關(guān)疾病的診治提供了新思路,以供借鑒。研究目的1.構(gòu)建新型隱球菌扁桃酸消旋酶(mandelate racemase, MRE)、過(guò)氧化氫銅胺氧化酶(peroxisomal copper amine oxidase, PCAO)和扁桃酸脫氫酶(mandelate dehydrogenase, LMD)基因突變菌株,并初步探究其對(duì)新生隱球菌毒力表型的影響；2.通過(guò)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì),分析2005年1月至2014年12月期間有關(guān)頭癬的文獻(xiàn)及病例報(bào)道,匯總我國(guó)近十年來(lái)關(guān)于頭癬發(fā)病情況,并針對(duì)臨床類型及病原菌進(jìn)行分析；3.比較MLPA.RCA兩種快速分子技術(shù)鑒定頭癬常見(jiàn)病原菌,紫色毛癬菌及犬小孢子菌及其相關(guān)菌株。研究方法第一部分：通過(guò)分析扁桃酸脫氫酶、過(guò)氧化氫銅胺氧化酶及扁桃酸消旋酶蛋白生理特性,設(shè)計(jì)基因特異性引物,利用套疊PCR的方法,構(gòu)建重組基因突變框,通過(guò)基因槍導(dǎo)入背景菌株JEC21,經(jīng)診斷性PCR及測(cè)序驗(yàn)證成功后,保藏菌株。同時(shí)分析突變菌株對(duì)于高溫、高滲、應(yīng)激、黑色素分泌、胞外莢膜等體外表型改變,為深入研究其生理機(jī)制奠下基礎(chǔ)第二部分：通過(guò)萬(wàn)方及Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)為搜索引擎以“頭癬”、"tinea capitis"為關(guān)鍵詞,進(jìn)行回顧性分析,統(tǒng)計(jì)搜索2005年1月至2014年12月期間相關(guān)頭癬文獻(xiàn)及相關(guān)的病例報(bào)道,排除明顯重復(fù)及信息不全的病例,并根據(jù)不同地區(qū)、頭癬的類別分析總結(jié)其頭癬流行病學(xué)發(fā)病率及主要致病菌的差異。第三部分：在本研究中,我們通過(guò)應(yīng)用并比較兩種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)：滾環(huán)快速擴(kuò)增法(rolling-circle amplification, RCA)和多重連接擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)鑒定紫色毛癬菌、犬小孢子菌及其相關(guān)菌株,其中包括美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)標(biāo)準(zhǔn)菌株4株、荷蘭標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏館(Centraalbureau voor Schimmelcultures, CBS)標(biāo)準(zhǔn)菌株13株及上海市醫(yī)學(xué)真菌保藏中心臨床菌株60株,其中含有22株的犬小孢子菌及31株紫色毛癬菌。根據(jù)其核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1和ITS2區(qū)域)基因序列的差異性設(shè)計(jì)特異性的探針,探針及引物在等溫條件下根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則在特定鏈置換酶的作用下能夠產(chǎn)生特異性的連接匹配,從而便與檢測(cè)其特異性；取等量的RCA、MLPA反應(yīng)模板,將其依次進(jìn)行的10倍濃度的稀釋,同樣的反應(yīng)體系進(jìn)行操作,檢測(cè)其敏感性；利用試劑SYBR GreenⅠ能夠與DNA雙鏈小溝結(jié)構(gòu)相結(jié)合的特點(diǎn),在PCR擴(kuò)增時(shí)一旦連接到DNA雙鏈結(jié)構(gòu)后,其就會(huì)釋放熒光信號(hào),而未連接到雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)SYBR GreenⅠ則不發(fā)射熒光,從而能夠更加直觀的進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果1.扁桃酸及其代謝對(duì)新生隱球菌毒力作用的探討：通過(guò)了解扁桃酸代謝通路,分析其蛋白生物信息學(xué)信息,發(fā)現(xiàn)扁桃酸消旋酶(mandelate racemase, MRE)在D血清型JEC21隱球菌中是由438個(gè)氨基酸組成,有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,而在A血清型H99標(biāo)準(zhǔn)菌株中是由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,存在種間的差異性；過(guò)氧化氫銅胺氧化酶(peroxisomal copper amine oxidase, PCAO)是銅胺氧化酶家族中的一份子,同扁桃酸脫氫酶(mandelate dehydrogenase, LMD)一樣,在兩種血清型中存在高度的同源性。成功構(gòu)建了扁桃酸消旋酶、過(guò)氧化氫銅胺氧化酶、扁桃酸脫氫酶JEC21基因缺陷菌株(mreA, pcaoA,lmd△)。并進(jìn)一步研究其對(duì)于隱球菌毒力表型的影響,發(fā)現(xiàn)MRE作為一種消旋酶可能更多參與扁桃酸光學(xué)手性的異構(gòu)性,對(duì)于功能影響上尚未有新的發(fā)現(xiàn)；缺陷菌株pcao△、imd△在高溫、高滲、氧化應(yīng)激等毒力減退,黑色素產(chǎn)生增加,而在有性生殖方面,突變菌株MAT lmd△×MAT a JEC20單交配相比JEC21×JEC20菌絲和擔(dān)孢子生成效率稍有下降,其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究探討。2.我國(guó)近十年頭癬流行病學(xué)分析情況：通過(guò)病例回顧性統(tǒng)計(jì)分析,在近十年來(lái)相關(guān)頭癬流行病的文獻(xiàn)總計(jì)7828個(gè)病例,其中男性病例數(shù)3519,女性病例數(shù)4309,男女比例0.82：1,兒童多見(jiàn),臨床類型以白癬最為多見(jiàn),共計(jì)2153例,占59.48%,膿癬、黑點(diǎn)癬次之；犬小孢子菌為主要的頭癬致病菌,共鑒定2510株,占55.58%,紫色毛癬菌占14.81%,鐵銹色小孢子菌及紅色毛癬菌病例數(shù)次之。3.比較兩種分子技術(shù)快速鑒定頭癬常見(jiàn)病原菌：通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)RCA法和MLPA法能夠快速鑒定常見(jiàn)頭癬致病菌,紫色毛癬菌和犬小孢子菌,且具有高度特異性和敏感性。兩種快速分子鑒定法特異性均可達(dá)100%；通過(guò)10倍滴度的依次稀釋,MLPA法檢測(cè)紫色毛癬菌敏感度低至101copies,犬小孢子菌探針敏感度低至102copies;RCA法鑒定紫色毛癬菌敏感性為106copies,犬小孢子菌敏感度為108copies;相比較之,MLPA法更加高效,而等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)為臨床的鑒定和診斷指明了新的簡(jiǎn)單易行、快速經(jīng)濟(jì)的新方向。研究結(jié)論1.扁桃酸及其代謝在隱球菌種間存在高度保守,通過(guò)構(gòu)建基因缺陷株(mre△, pcaoA,lmd△),發(fā)現(xiàn)pcao△,lmd△在隱球菌毒力表型及有性生殖方面上毒力減弱；mre△可能介導(dǎo)扁桃酸的旋光異構(gòu)性,對(duì)于隱球菌毒力表型影響不大；2.近十年來(lái),我國(guó)頭癬病情發(fā)展相對(duì)緩慢,主要感染兒童,臨床類型以白癬為主,主要致病菌為犬小孢子菌和紫色毛癬菌；3.基于犬小孢子菌、紫色毛癬菌ITS序列設(shè)計(jì)的探針通過(guò)MLPA法和RCA法能夠快速、高效而特異性的鑒別頭癬感染；4.MLPA法相比RCA法能夠更高的敏感的鑒別犬小孢子菌和紫色毛癬菌。
【關(guān)鍵詞】：扁桃酸 隱球菌 頭癬 等溫?cái)U(kuò)增法 MLPA RCA
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R756.1
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 中英文縮略詞對(duì)照表13-14
• 前言14-17
• 第一部分 扁桃酸及其代謝對(duì)新型隱球菌毒力作用的探討17-28
• 引言17-18
• 一、材料與方法18-21
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-26
• 三、實(shí)驗(yàn)討論26-28
• 第二部分 我國(guó)近十年頭癬流行病學(xué)分析28-32
• 引言28
• 一、材料與方法28-29
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-30
• 三、實(shí)驗(yàn)討論30-32
• 第三部分 比較兩種分子技術(shù)快速鑒定頭癬常見(jiàn)病原菌32-54
• 引言32-33
• 一、實(shí)驗(yàn)材料33-39
• 二、實(shí)驗(yàn)方法39-46
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-51
• 四、實(shí)驗(yàn)討論51-54
• 全文總結(jié)54-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 文獻(xiàn)綜述61-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 發(fā)表論文與科研工作68-69
• 致謝69

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 江小穗,張敏如;扁桃酸抗陰道滴蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)與臨床研究[J];陜西新醫(yī)藥;1983年12期

2 李寶麟,蘆燕青;扁桃酸及扁桃酸避孕制品的誘變性研究[J];癌變.畸變.突變;1991年02期

3 司開(kāi)衛(wèi),李哲,程彥斌;扁桃酸對(duì)感染小鼠腹水中弓形蟲(chóng)速殖子超微結(jié)構(gòu)的影響[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)病防治雜志;2000年04期

4 郭黛蘋(píng);李忠琴;楊凱;楊元營(yíng);許小平;;手性藥物前體R(-)-扁桃酸的生物不對(duì)稱合成[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)工程;2006年06期

5 嚴(yán)芬;郭養(yǎng)浩;林木仙;劉盈盈;;釀酒酵母中的D-(-)-扁桃酸脫氫酶[J];藥物生物技術(shù);2007年01期

6 郭黛蘋(píng);許小平;楊凱;李忠琴;;(R)-( )-扁桃酸的不對(duì)稱生物合成[J];中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志;2007年07期

7 陳鐘華;王莉華;;環(huán)扁桃酸酯中酮酯的檢查(分光光度法)[J];南京藥學(xué)院學(xué)報(bào);1983年02期

8 陳楚良;施幼芳;林福云;殷芬;戴巧鳳;;氣相色譜法測(cè)定尿中的扁桃酸[J];化工勞動(dòng)保護(hù)(工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病分冊(cè));1983年02期

9 陳楚良;;氣相色譜法測(cè)定尿中的扁桃酸(摘要)[J];鐵道勞動(dòng)衛(wèi)生通訊;1984年04期

10 張敏如,陳金典;扁桃酸酰胺對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)作用的電鏡觀察[J];寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;1986年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 嚴(yán)芬;黃雅燕;郭養(yǎng)浩;;手性藥物中間體R(-)-扁桃酸的不對(duì)稱合成及扁桃酸脫氫酶特性研究[A];第一屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

2 孫利民;吉愛(ài)國(guó);孟召力;梁浩;;R(-)-扁桃酸甲酯的化學(xué)-生物合成[A];中國(guó)資源生物技術(shù)與糖工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

3 韋晗寧;石玲玲;武波;;篩選立體特異性脂肪酶拆分消旋扁桃酸甲酯制備S-扁桃酸[A];第二屆中國(guó)青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

4 張和順;;高效液相色譜法測(cè)定尿中3—甲氧基—4—羥基扁桃酸[A];天津市第四次色譜學(xué)術(shù)交流會(huì)論文（摘要）匯集[C];1985年

5 姚紅偉;蘇娜娜;王力鐘;李正名;趙衛(wèi)光;;2-扁桃�；�-1,2,3,4-四氫異喹啉類化合物的合成及生物活性[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第26屆學(xué)術(shù)年會(huì)化學(xué)生物分會(huì)場(chǎng)論文集[C];2008年

6 龍璽國(guó);黃丹鳳;胡雨來(lái);;普拉格雷中間體的合成研究[A];甘肅省化學(xué)會(huì)第二十七屆年會(huì)暨第九屆甘肅省中學(xué)化學(xué)教學(xué)經(jīng)驗(yàn)交流會(huì)論文摘要集[C];2011年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張楠;扁桃酸——重要的手性藥物中間體[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

2 張楠;手性化合物扁桃酸開(kāi)發(fā)前景廣闊[N];中國(guó)化工報(bào);2002年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 鞠鑫;假單胞菌酯酶的發(fā)現(xiàn)及其在制備手性扁桃酸中的應(yīng)用[D];華東理工大學(xué);2011年

2 張志鈞;腈水解酶催化制備光學(xué)純扁桃酸的性能及羥腈裂解酶的理性改造研究[D];華東理工大學(xué);2013年

3 顧佳黎;扁桃酸消旋酶和酯酶BioH的理性設(shè)計(jì)及其應(yīng)用研究[D];浙江大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王W，

本文編號(hào)：341188