【摘要】：結(jié)構(gòu)決定功能。結(jié)構(gòu)解析是理解各種基本生命過(guò)程分子機(jī)制的重要途徑。傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)解析方法如X射線晶體衍射學(xué)和核磁共振方法(NMR)已產(chǎn)生大量蛋白結(jié)構(gòu),極大豐富了我們對(duì)細(xì)胞中各種重要蛋白作用機(jī)制的理解。然而,由于需要對(duì)蛋白進(jìn)行結(jié)晶,X射線晶體衍射學(xué)方法很難應(yīng)用于不易體外表達(dá)或結(jié)晶的蛋白,尤其是一些重要的蛋白復(fù)合物和膜蛋白。核磁共振方法不但需要大量高純度蛋白,而且只適用于小分子量蛋白。近年來(lái)隨著技術(shù)進(jìn)步,冷凍電鏡方法逐漸成為蛋白原子分辨率結(jié)構(gòu)解析的常規(guī)方法。冷凍電鏡方法的優(yōu)勢(shì)是只需要極少量的蛋白樣品,且對(duì)蛋白純度要求不高。這里我展示冷凍電鏡在解析富有挑戰(zhàn)性的蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的兩例成功應(yīng)用。首先,我們使用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析CENP-LN復(fù)合物對(duì)CENP-A核小體特異性識(shí)別的分子機(jī)制。CENP-LN復(fù)合物對(duì)CENP-A核小體的識(shí)別是動(dòng)粒組裝過(guò)程的關(guān)鍵步驟,對(duì)有絲分裂中遺傳物質(zhì)的準(zhǔn)確分離有重要影響。由于狀態(tài)均一的CENP-LN/CENP-A核小體樣品制備極其困難,研究人員未能通過(guò)X射線晶體衍射學(xué)方法獲得該復(fù)合物高分辨結(jié)構(gòu)。我們使用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)克服了樣品組成及狀態(tài)不均一問(wèn)題,獲得了整體分辨率5.8 A的CENP-LN/CENP-A核小體結(jié)構(gòu)。我們發(fā)現(xiàn)CENP-N可以和CENP-A RG loop及核小體DNA相互作用從而特異性識(shí)別CENP-A核小體。我們進(jìn)一步提出一種基于冷凍電鏡成像的自下而上的結(jié)構(gòu)蛋白組學(xué)方法,從含有多種內(nèi)源蛋白復(fù)合物的樣品中獲得多個(gè)原子分辨率結(jié)構(gòu),以此來(lái)研究富有挑戰(zhàn)性的生物系統(tǒng)。我們的方法直接從待研究的細(xì)胞勻漿(cellularmilieu)中富集多種內(nèi)源蛋白,利用冷凍電鏡單顆粒分析方法從頭(ab initio)重構(gòu)出多個(gè)近原子分辨率電鏡結(jié)構(gòu),并完成蛋白序列鑒別、原子模型搭建。我們新開(kāi)發(fā)的程序cryoID可從成千上萬(wàn)個(gè)候選序列中高效鑒別未知的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)蛋白序列。我們將此方法應(yīng)用于惡性瘧原蟲(chóng)(malariaparasite Plasmoaium falciparum)并獲得了對(duì)瘧原蟲(chóng)在紅細(xì)胞中存活有重要作用的多個(gè)蛋白復(fù)合物近原子分辨率結(jié)構(gòu),從而證明了該方法有效性。我們的結(jié)果表明,冷凍電鏡單顆粒技術(shù)適于研究對(duì)傳統(tǒng)方法構(gòu)成極大挑戰(zhàn)的蛋白復(fù)合物或生物系統(tǒng)。
【圖文】：

第１章緒論逡逑１．１電子顯微鏡的誕生及在生命科學(xué)中的早期應(yīng)用逡逑眼見(jiàn)為實(shí)——顯微成像技術(shù)憑借其直觀特性，是進(jìn)行生命科學(xué)研宄尤其是微逡逑觀層面研究不可或缺的工具。自發(fā)明以來(lái)，光學(xué)顯微鏡使得人們可以從細(xì)胞層面逡逑直接觀察生物樣品（如微生物、動(dòng)物組織樣本等），極大地促進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)逡逑展。但由于光學(xué)衍射極限的存在，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡所得到的最高分辨率約為光逡逑子的波長(zhǎng)（幾百納米），很難應(yīng)用于亞納米尺度的蛋白功能相應(yīng)的分子機(jī)理研宄。逡逑工欲善其事必先利其器。為在亞細(xì)胞層面乃至分子層面觀察并理解生命過(guò)程，新逡逑的顯微成像方法需要被開(kāi)發(fā)出來(lái)。逡逑１．１．１電子顯微鏡的誕生逡逑

圖１．１．２｜電子顯微鏡拍攝的生物樣品圖片（Ａ）桂藻Ａｍｐｈｉｐｌｅｕｒａｐｅｌｌｕｃｉｄａ電子顯微鏡下逡逑圖片。ＨｅｉｎｚＯｔｔｏＭｉｉｌｌｅｒ和ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＫｒａｕｓｅ利用圖１．１．１中電子顯微鏡拍攝。（Ｂ）噬菌體逡逑（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ）電子顯微鏡下圖片。由Ｈｅｌｍｕｔ邋Ｒｕｓｋａ利用電子顯微鏡拍攝。改編自（Ｅ．逡逑Ｒｕｓｋａ，邋１９８６）。逡逑電子顯微鏡被發(fā)明后很快應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研宄。Ｈｅｉｎｚ邋Ｏｔｔｏ邋ＭＵｌｌｅｒ和逡逑ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＫｒａｕｓｅ利用Ｅｒｎｓｔ邋Ｒｕｓｋａ在１９３３年建造的電子顯微鏡拍攝了一系列生物逡逑樣品，包括家繩翅膀、硅藻、微生物等，，并不斷獲得更好的結(jié)果。掛藻Ａｍｐｈｉｐｌｅｕｒａ逡逑ｅｌｌｕｃｉｄａ（ｔｒａｎｓａｉｃａｌ邋ｓｔｒｉａｅ）在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法分辨，但在電逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q51

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本文編號(hào)：2658583