【摘要】：蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一種需氧,能夠形成孢子的革蘭氏陽性菌,在孢子形成的期間能夠產(chǎn)生昆蟲病原細(xì)菌伴孢晶體蛋白或δ-內(nèi)毒素。這些Cry蛋白對多種害蟲具有毒性,例如鱗翅目,鞘翅目,雙翅目和線蟲。蘇云金芽孢桿菌被認(rèn)為是最成功的微生物殺蟲劑。此外,Bt毒素基因也已被有效地用于增強(qiáng)對昆蟲害蟲的抗性轉(zhuǎn)基因作物。在過去的幾十年里,Bt及其毒素是研究最多一種生物殺蟲劑。然而,一些害蟲正在逐漸地或已經(jīng)對常用的基于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲劑產(chǎn)生了的耐性,從而在某種程度上削弱了Bt類的殺蟲劑的功效。因此,迫切的需要尋找具有不同的作用模式和特異性的Bt菌株和毒素蛋白,從而能夠延續(xù)和提升這種細(xì)菌的殺蟲活性。隨著第二代測序技術(shù)的發(fā)展和新的組學(xué)概念的提出,更多的蘇云金芽孢桿菌完成了全基因組測序和蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜分析,為大規(guī)模高效率地識別新的菌株和新的毒素蛋白提供了前所未有的機(jī)遇。然而整合并且挖掘這些高通量的數(shù)據(jù)對于實驗生物學(xué)家而言是一個重要挑戰(zhàn),因此有必要開發(fā)面向?qū)嶒灴茖W(xué)家的精確高效的數(shù)據(jù)庫平臺以及分析軟件,系統(tǒng)的識別新的Bt毒蛋白。通過結(jié)合基因組比較分析能夠更加深入了解芽孢桿菌屬物種之間的基因組多樣性以及不同的Bt亞種菌株之間的多樣性,對深入理解蘇云金芽苞桿菌的基因組特征和基因功能具有重要的意義。本實驗室首先對從不同地域分離得到的6個Bt分離株進(jìn)行全基因組測序,在該研究中,基于2016年6月之前公開的蘇云金芽孢桿菌的基因組作為參考基因組,利用改進(jìn)后的組裝程序?qū)caffolds進(jìn)行進(jìn)一步的組裝排序,構(gòu)建了這6種菌株的基因組草圖,并對基因組中的編碼基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測和功能注釋。通過功能注釋分析,我們發(fā)現(xiàn)菌株中平均有56.3%的CDS能注釋到相應(yīng)的功能區(qū)域,通過對這6種蘇云金芽孢桿菌分離株的基因組結(jié)構(gòu)的分析,構(gòu)建了Bt分離株基因組草圖,和相應(yīng)的基因組特征的分析,可以為后續(xù)的毒蛋白的識別提供一定的理論基礎(chǔ)。其次,本研究中著重對比較感興趣的蘇云金芽孢桿菌菌株S2160-1的預(yù)測基因進(jìn)行了功能分析,為后續(xù)的毒蛋白的識別奠定一定的理論依據(jù)。毒理試驗表明S2160-1具有較高的滅蚊活性,為了識別和研究S2160-1菌株中的毒蛋白,將預(yù)測到的Bt S2160-1編碼蛋白質(zhì)與從公共資源中獲取的653條毒蛋白氨基酸序列構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(e-value=0.00001)。S2160-1基因組中識別到了 46個候選毒蛋白基因。為了進(jìn)一步對這些候選毒蛋白編碼基因進(jìn)行篩選,對這些預(yù)測毒蛋白進(jìn)行了一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的分析。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明,這些預(yù)測毒蛋白長度變化范圍在42～1216個氨基酸,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在4.86 kDa和137.28 kDa之間,蛋白質(zhì)的等電點在4.3和10.06之間,其中pH大于7的蛋白質(zhì)有16個。三級結(jié)構(gòu)域和PFAM功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明,在質(zhì)粒基因組中有13個候選毒蛋白具有典型內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)域:Endotoxin N,Endotoxin_M,delta_endotoxin_C。因而推測,在Bt S2160-1菌株中可能具有13個編碼毒蛋白基因,為了研究這些毒蛋白與已知的Bt毒蛋白之間關(guān)系,將11個已知的Bt菌株的90個編碼毒蛋白基因與S2160-1的13個候選毒蛋白進(jìn)行MEGA進(jìn)化分析。通過進(jìn)化分析,可以為S2160-1候選毒蛋白基因進(jìn)行國際命名提供一定的參考價值,為候選毒蛋白的功能分析提供一定的理論基礎(chǔ)。其次,為了比較這6種蘇云金芽孢桿菌與其他已知的菌種和親緣關(guān)系比較近的菌株間的關(guān)系,基于芽孢桿菌的三種不同的細(xì)菌菌種,基于公眾發(fā)表的可獲得的完整基因組序列。用于分析的菌株包括17個蘇云金芽孢桿菌基因組,其中11個是從公眾數(shù)據(jù)庫中獲得的,13個蠟狀芽孢桿菌和8個炭疽桿菌的基因組。除了對每一種菌種進(jìn)行了泛基因組和核基因組的分析外,還研究了包括17個蘇云金芽苞桿菌、炭疽桿菌參考基因組和蠟狀芽孢桿菌參考基因組的芽孢桿菌屬的泛基因組和核基因組。事實證明在分析的三種菌種中所必須的基因的數(shù)目以及平均基因的數(shù)目相差不大,也進(jìn)一步說明了這三種物種的親緣關(guān)系比較近。但是也存在這一定的差異,通過基因組一致性分析表發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌中,基因組的一致性得分與炭疽桿菌和蠟狀芽孢桿菌相比較,整體是處于偏低的狀態(tài)的,這也從另一個方面說明蘇云金芽孢桿菌菌種對應(yīng)的泛基因組和核基因組曲線變化比其余兩種菌種的泛基因組和核基因組的曲線變化趨勢強(qiáng)烈的原因。對蘇云金芽孢桿菌和炭疽桿菌的核基因和泛基因進(jìn)行直向同源的聚類組(COG)類的分布情況的不同再次對他們的泛基因組和核基因組進(jìn)行比較分析。這項研究說明如何可已利用生物信息學(xué)工具對廣泛的基因組進(jìn)行簡單比較的方法,通過已知的信息來深入的了解未知的現(xiàn)象。最后,本研究匯總了蘇云金芽孢桿菌的公布的全基因組測序相關(guān)數(shù)據(jù),以及我們實驗室分離得到的菌株的基因組信息和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)構(gòu)建了蘇云金芽孢桿菌組學(xué)數(shù)據(jù)庫Btomics,構(gòu)建了基因組測序數(shù)據(jù)地分析平臺,該數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建為實驗學(xué)者提供關(guān)門存儲蘇云金芽孢桿菌的基因組信息和其他的信息的查詢。同時,本文還構(gòu)建了蘇云金芽孢桿菌的毒蛋白數(shù)據(jù)庫,該數(shù)據(jù)庫中通過人工挖掘和文獻(xiàn)搜索的方式收集了所有的已知的毒蛋白的相關(guān)信息,而且還構(gòu)建了基于序列相似性的毒蛋白預(yù)測軟件。兩個關(guān)于蘇云金芽孢桿菌數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建不僅能夠為實驗室的數(shù)據(jù)的提供存儲和查詢,而且有利于數(shù)據(jù)的交流共享以及實驗科學(xué)家方便快捷地從事蘇云金芽孢桿菌地生物信息學(xué)分析。
【圖文】：

ＣＯＧ數(shù)據(jù)庫功能注釋分析，大量蛋白質(zhì)已經(jīng)被分配到直向同源簇的功能類別。因此，逡逑接下來對炭疽桿菌和蘇云金芽孢桿菌基因組的泛基因組和核基因組進(jìn)行ＣＯＧ功能分逡逑析，并比較了這兩個菌株的核和泛基因組基因?qū)?yīng)ＣＯＧ功能統(tǒng)計分布情況（圖４－７）。逡逑炭疽桿菌的ＣＯＧ功能統(tǒng)計分析如圖４－７邋Ａ和Ｂ中的餅圖。在底部，圖例指定４個頂級逡逑ＣＯＧ類別：？？信息的存儲和處理＇邋？？細(xì)胞過程和信號傳導(dǎo)代謝”以及一些沒有注釋的逡逑ＣＯＧ類別，這四大類頂級ＣＯＧ類別又被分成２６個基因功能類，何是炭疽桿菌的泛基逡逑因組只注釋到了邋１８個ＣＯＧ功能類。炭疽桿菌的完整泛基因組基因的ＣＯＧ功能分類逡逑（４－７Ａ）和保守核心基岡（４－７Ｂ）的ＣＯＧ功能注釋。正如所預(yù)期那樣，在泛基因組中逡逑功能不確定或根本無法進(jìn)行功能預(yù)測的基因在泛基因組中占有較大的比例。這一部分基逡逑因約占泛基因組的５４％，包括沒有同源基因、常見功能的預(yù)測分析以及功能未知的基逡逑因。但是這一部分基因中的部分基因從核基因組中移除，主要是由于這些基因在菌種之逡逑間的存在著變化，從而不存在核廟因組中。更讓人驚訝的是，從餅圖上來看，如果忽略逡逑灰色和黑色部分的話，，會發(fā)現(xiàn)泛基因組種的基因和核基因組種的基因幾乎是很相似的分逡逑布在三種ＣＯＧ的三大功能類別中類別。相比泛基因組的基因功能的分布
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S476.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2630001