本文關(guān)鍵詞： 質(zhì)譜 RNA編輯酶 蛋白質(zhì)組學(xué) 增殖細(xì)胞核抗原 蛋白翻譯 細(xì)胞增殖 H2A/K 長(zhǎng)非編碼RNA 質(zhì)譜 定量蛋白質(zhì)組學(xué) 增殖細(xì)胞核抗原 細(xì)胞增殖　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景作用于RNA的腺嘌呤脫氨基酶(ADAR)是雙鏈RNA編輯酶的一種,這種酶能特異地把雙鏈RNA上的腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤(Ⅰ),在RNA的翻譯或反轉(zhuǎn)錄時(shí)次黃嘌呤(Ⅰ)會(huì)作為鳥嘌呤(G)翻譯或反轉(zhuǎn)錄。ADAR同源基因存在于從單細(xì)胞的原核生物到人等的廣泛生物中,可見這個(gè)基因在進(jìn)化上非常保守。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)RNA的腺嘌呤脫氨基酶(ADAR)有三種類型,分別是ADAR1、ADAR2和ADAR3。ADAR3只在腦中表達(dá)。ADARl和ADAR2廣泛存在于多種組織內(nèi),其中ADARl被研究較多。ADAR1有兩種亞型：一種是分子量為150kd全長(zhǎng)的能核質(zhì)穿梭的p150和另一種是分子量為110kd非全長(zhǎng)的只分布核內(nèi)的p110。全長(zhǎng)的ADAR1由N端的2個(gè)ZDNA結(jié)構(gòu)域及3個(gè)雙鏈RNA結(jié)合域和C端的1個(gè)末端有入核序列的脫氨基酶結(jié)構(gòu)域組成,在全長(zhǎng)ADAR1的N端有出核序列。在這里,ADAR1指全長(zhǎng)的分子量為150kd-型。ADAR1是胚胎發(fā)育必需的重要蛋白,雜交鼠實(shí)驗(yàn)證明,ADAR1表達(dá)減少的胚胎干細(xì)胞不能發(fā)育成肝、骨髓、脾、胸腺和血液紅細(xì)胞,因而,ADAR1是哺乳動(dòng)物發(fā)育所必需的基因。ADAR1廣泛存在于真核細(xì)胞中,同時(shí)參與多種細(xì)胞過(guò)程,比如胚胎紅細(xì)胞形成、免疫反應(yīng)和細(xì)胞各種應(yīng)激過(guò)程。鑒于ADAR1下調(diào)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的現(xiàn)象,我們想至ADAR1過(guò)表達(dá)會(huì)改變細(xì)胞功能,在這里我們應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)研究ADAR1過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。研究目的1.應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析ADAR1對(duì)細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響2.證明ADAR1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能研究方法1-構(gòu)建表達(dá)ADAR1質(zhì)粒把編碼小鼠全長(zhǎng)ADAR1氨基酸的cDNA序列克隆到pEGFP-N1載體上,構(gòu)建ADAR1表達(dá)質(zhì)粒。用同樣方法把缺少脫氨基酶域的突變ADAR1序列克隆到pEGFP-N1載體上,構(gòu)建對(duì)照質(zhì)粒Mutant。2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人腎細(xì)胞HEK293T被放在改良的高糖培養(yǎng)基DMEM(10%FBS)中,在37℃含有5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DNA轉(zhuǎn)染使用英濰捷基公司的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑完成3.蛋白提取用于細(xì)胞外ADAR1活性檢測(cè)和蛋白質(zhì)組分析分別轉(zhuǎn)染N1_ADAR1和N1_mutant質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后,使用預(yù)冷的帶有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。4.雙鏈RNA制備和細(xì)胞外ADAR1編輯活性測(cè)定1飛摩爾的雙鏈RNA底物分別加入到混有50微克表達(dá)ADAR1細(xì)胞蛋白或表達(dá)Mutant細(xì)胞蛋白的0.5毫升編輯緩沖液中,混勻后在37度孵育2小時(shí)。純化編輯后的雙鏈RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈,PCR擴(kuò)增被編輯的RNA底物,經(jīng)PCR清潔試劑盒純化后測(cè)序。5.蛋白溶液內(nèi)胰酶酶解對(duì)于定量蛋白質(zhì)組分析,200微克的細(xì)胞裂解液加入二硫蘇糖醇(DTT)到20mM摩爾濃度,置于56度還原30分鐘去掉二硫鍵,然后加入碘乙酰胺(IAA)到50mM摩爾濃度,避光置于26度20分鐘,烷基化保護(hù)已經(jīng)被還原的二硫鍵。之后加入測(cè)序級(jí)修飾過(guò)的胰酶(1：50的質(zhì)量比)置于37度消化24小時(shí),消化后的蛋白溶液用10k的超濾管以15000g離心30分鐘超濾得到肽段,超濾過(guò)的肽段混合液用ZipTip C18柱子脫鹽純化,然后收集脫鹽純化后的肽段,凍干后放在-20度保存用于進(jìn)一步分析。6.色譜-二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析肽段是采用高壓液相色譜(HPLC, Thermo EASY-nLC System)分離和用電噴霧串聯(lián)的混合線性離子井質(zhì)譜儀(Thermo LTQ Orbitrap Velos Elite, Thermo)測(cè)定肽段的質(zhì)荷比進(jìn)行分析。對(duì)于每一次分析,樣品先加到C18預(yù)分析柱上,然后通過(guò)C18反相分析柱,用線性的溶劑梯度把肽段從C18分析柱上洗脫下來(lái)。肽段以陽(yáng)離子模式進(jìn)行分析,一級(jí)質(zhì)譜使用離子井分析儀以質(zhì)荷比范圍在300-1800之間,分辨率為60,000以圖譜方式獲得。二級(jí)質(zhì)譜分析通過(guò)誘導(dǎo)碰撞解離模式(CID)完成。以相同方式完成3次重復(fù)樣品的分析。7.數(shù)據(jù)分析和肽段鑒定來(lái)源于每個(gè)樣品的二級(jí)質(zhì)譜(CID)數(shù)據(jù)使用蛋白質(zhì)組分析軟件(Proteome Discoverer 1.4)以2014年10月21日SWISS-PROT中人的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)進(jìn)行蛋白搜索鑒定。8.蛋白的非標(biāo)記定量所有6個(gè)樣品質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)使用Progenesis LC-MS軟件(4.1版本：Nonlinear Dynamics,英國(guó))進(jìn)行非標(biāo)記蛋白定量分析。定量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以ANOVA t test p0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,當(dāng)?shù)鞍棕S度改變小于1.5倍(ADAR1/mutant)時(shí)蛋白被拋棄。9.差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析來(lái)自于Progenesis LC-MS軟件分析的ADAR1和Mutant組間差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù),通過(guò)著名的PANTHER(http://www.pantherdb.org/)基因聚類軟件分析,得到因ADAR1過(guò)表達(dá)而調(diào)整的蛋白功能分類的分析結(jié)果；通過(guò)著名的STRING (http://www.string-db.org/)蛋白相互作用軟件分析。得到因ADAR1過(guò)表達(dá)而調(diào)整的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果。10.蛋白Western blot分析Western blot分析由分別轉(zhuǎn)染ADAR1和Mutant質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞提取的蛋白來(lái)完成,細(xì)胞在冰冷RIPA裂解液中裂解和進(jìn)行蛋白提取。上樣的50微克蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)到NC膜上,經(jīng)5%牛血清蛋白封閉后孵育一抗、孵育二抗和掃膜,用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析。11.細(xì)胞增殖檢測(cè)11.1 EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)HEK293T細(xì)胞和A549細(xì)胞分別以2500細(xì)胞／孔的密度種植在24孔板的12個(gè)孔上(HEK293T細(xì)胞和A549細(xì)胞各兩組,每組3個(gè)孔)。在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中37度培養(yǎng)12小時(shí),然后按之前轉(zhuǎn)染步驟按比例分別轉(zhuǎn)染ADAR1質(zhì)粒和Mutant質(zhì)粒到HEK293T細(xì)胞兩個(gè)組或A549細(xì)胞兩個(gè)組中。36個(gè)小時(shí)之后,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用EdU細(xì)胞增殖試劑盒來(lái)完成。EdU標(biāo)記新增殖的細(xì)胞(紅色)和Hoechst 33342標(biāo)記全部細(xì)胞(藍(lán)色)后,選取200倍的放大倍數(shù)在倒置熒光顯微鏡下觀察。使用Image-Pro Plus 6.0 (IPP 6.0)軟件計(jì)算分析EDU陽(yáng)性的增殖細(xì)胞在全部細(xì)胞中的比率。11.2 MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖,在這個(gè)檢測(cè)中,HEK293T細(xì)胞和A549細(xì)胞分別以每孔3000個(gè)細(xì)胞密度種植在96孔板中,兩種細(xì)胞分別以兩組每組重復(fù)5孔種植。在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中37度培養(yǎng)24小時(shí),DNA轉(zhuǎn)染用lipo-2000按之前轉(zhuǎn)染步驟按比例在每種細(xì)胞的兩組中分別轉(zhuǎn)染ADAR1質(zhì)粒和Mutant質(zhì)粒。孵育48小時(shí)后,在每孔100微升的培養(yǎng)基中加入10微升的MTT溶液,孵育4個(gè)小時(shí)后,小心地去掉培養(yǎng)基,每孔加入100微升的DMSO溶解結(jié)晶,然后用酶標(biāo)儀在570納米和630納米兩個(gè)波長(zhǎng)上測(cè)定OD值。570納米測(cè)定的吸光度減去630納米測(cè)定的吸光度(培養(yǎng)板塑料孔和細(xì)胞碎屑引起的吸光度),然后對(duì)測(cè)得的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ANOVAttest用于蛋白定量統(tǒng)計(jì)分析,當(dāng)p0.05時(shí)被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他定量分析應(yīng)用Student' sttest檢驗(yàn),當(dāng)p0.05時(shí)被被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。定量數(shù)據(jù)由平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。研究結(jié)果1. HEK293T細(xì)胞中ADAR1的表達(dá)增加雙鏈RNA編輯活性2. 過(guò)表達(dá)ADAR1改變了HEK293T細(xì)胞中的蛋白表達(dá)HEK293T細(xì)胞表達(dá)的ADARl改變了細(xì)胞蛋白表達(dá),在370個(gè)有差異變化的蛋白表達(dá)中,211個(gè)蛋白被上調(diào)和159個(gè)蛋白被下調(diào)。這些數(shù)據(jù)顯示了轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞表達(dá)的ADAR1改變了細(xì)胞蛋白表達(dá)。3. ADAR1調(diào)整的差異表達(dá)蛋白聚類分析為ADARl促進(jìn)細(xì)胞增殖提供了分子水平的支持4. ADARl過(guò)表達(dá)上調(diào)了蛋白翻譯和細(xì)胞周期兩個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示ADAR1過(guò)表達(dá)調(diào)整了蛋白翻譯和細(xì)胞周期兩個(gè)網(wǎng)絡(luò),蛋白翻譯網(wǎng)絡(luò)包括4個(gè)核糖體小亞基蛋白(RPS5、RPS3、RPS13和RPS10),7個(gè)核糖體大亞基蛋白(RPL7、RPL10、RPL22、RPL28、RPL35、RPL36A和MRPL49),6個(gè)真核細(xì)胞翻譯起始因子(EIF3A、EIF3G、EIF3I、 EIF3L、EIF4G2和EIF5B)和2個(gè)真核細(xì)胞翻譯延伸因子(EEF1A1和EEF1A2)。細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)是以增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)為中心的網(wǎng)絡(luò)。5. ADAR1過(guò)表達(dá)上調(diào)了PCNA-細(xì)胞增殖蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)在PCNA蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)里,PCNA是通過(guò)與其他蛋白KA-box和/或PIP-box相互作用,這些上調(diào)的蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖。這些通過(guò)KA-box和／或PIP-box與PCNA相互作用的ADAR1調(diào)整的細(xì)胞增殖類蛋白包括前mRNA處理因子19 (PRPF19),X射線互補(bǔ)缺陷修復(fù)蛋白(XRCC5)。6. Western blotting分析確認(rèn)了過(guò)表達(dá)ADAR1上調(diào)一些與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白。western blotting分析結(jié)果與非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組分析結(jié)果一樣,轉(zhuǎn)染ADAR1的HEK293T細(xì)胞中,代表細(xì)胞增殖標(biāo)志的PCNA蛋白表達(dá)上調(diào)2.0倍(p0.01,n=3),前mRNA處理因子19 (PRPF19)上調(diào)1.76倍(p0.01,n=3)和X射線互補(bǔ)缺陷修復(fù)蛋白(XRCC5)上調(diào)1.6倍(p0.01,n=3)。核輸出蛋白Exportin-5調(diào)節(jié)與蛋白翻譯有關(guān)的成分(包括延伸因子a1, tRNA和信號(hào)識(shí)別顆粒RNA)。Western blotting分析結(jié)果顯示ADAR1過(guò)表達(dá)上調(diào)Exportin-5到1.56倍(p0.01,n=3)。7.細(xì)胞增殖功能檢驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)ADAR1的HEK293T細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖比率增加應(yīng)用5-乙炔基-2脫氧尿苷(EDU)和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)兩種方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)ADAR1的HEK293T細(xì)胞和A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖率。EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果是：過(guò)表達(dá)ADAR1的HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞增殖比率是0.58+0.08,轉(zhuǎn)染Mutant的HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞增殖比率是0.26+0.04；過(guò)表達(dá)ADAR1的A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖比率是0.24+0.04,轉(zhuǎn)染Mutant的A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖比率是0.15+0.01；數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果與非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組分析一致,過(guò)表達(dá)的ADAR1上調(diào)HEK293T細(xì)胞增殖比率2.2倍(p0.01,n=3),同時(shí)過(guò)表達(dá)的ADAR1上調(diào)A549細(xì)胞增殖比率1.6倍(p0.01,n=3)。MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果是：過(guò)表達(dá)ADAR1的HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞增殖指數(shù)是1.59+0.20,轉(zhuǎn)染Mutant的HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞增殖指數(shù)是0.79±0.10；過(guò)表達(dá)ADAR1的A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖指數(shù)是0.96±0.14,轉(zhuǎn)染Mutant的A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖指數(shù)是0.59±0.14；數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果也與非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組分析一致,過(guò)表達(dá)的ADAR1上調(diào)HEK293T細(xì)胞增殖指數(shù)2.0倍(p0.001,n=3),同時(shí)過(guò)表達(dá)的ADAR1上調(diào)A549細(xì)胞增殖指數(shù)1.6倍(p0.001,n=3)。結(jié)論1.通過(guò)應(yīng)用液相-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和非標(biāo)記定量的蛋白質(zhì)組分析,我們認(rèn)為過(guò)表達(dá)的ADAR1上調(diào)了基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、蛋白運(yùn)輸和細(xì)胞周期過(guò)程相關(guān)基因,這些被上調(diào)的相關(guān)基因都有利于細(xì)胞增殖。2.過(guò)表達(dá)的ADAR1上調(diào)了蛋白翻譯相互作用網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞周期相互作用網(wǎng)絡(luò),同時(shí)過(guò)表達(dá)的ADAR1上調(diào)了以增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)為核心的細(xì)胞增殖相互作用網(wǎng)絡(luò),過(guò)表達(dá)的ADAR1上調(diào)的這三個(gè)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)共同促進(jìn)了細(xì)胞增殖。從而在蛋白分子水平上證明了ADAR1過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。3.兩種方法的細(xì)胞增殖功能實(shí)驗(yàn)都證明了過(guò)表達(dá)的ADAR1能促進(jìn)HEK293T細(xì)胞和A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖比率,在細(xì)胞水平上也確定了ADAR1促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)果。過(guò)表達(dá)的ADAR1促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能在蛋白質(zhì)組分子水平上和細(xì)胞水平上都得到了證明研究背景一些假基因通過(guò)形成長(zhǎng)非編碼RNA作用于相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄子而被認(rèn)為有活性。HIST1H2APS4也稱為H2A/K,是一個(gè)假基因,然而很少有人關(guān)注這個(gè)假基因,更很少有人對(duì)這個(gè)假基因突變進(jìn)一步研究。我們實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,10個(gè)腎癌病人中7個(gè)攜帶突變的H2A/K假基因：其中4個(gè)腎癌病人攜帶的突變H2A/K假基因是C228A突變；2個(gè)腎癌病人攜帶的突變H2A/K假基因是C290T突變；1個(gè)腎癌病人攜帶的突變H2A/K假基因是A45G突變。然而在對(duì)照組的12個(gè)健康人中沒有發(fā)現(xiàn)突變H2A/K非編碼RNA。通過(guò)Fisher' s exact統(tǒng)計(jì)分析,我們發(fā)現(xiàn)這個(gè)結(jié)果是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher's exact test, p=0.0007036),同時(shí)我們對(duì)突變的H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA和細(xì)胞增殖之間是否存在聯(lián)系而感興趣。所以我們使用質(zhì)譜蛋白質(zhì)組shotgun方法,用胰酶酶解細(xì)胞蛋白成肽段,然后利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜來(lái)進(jìn)行分析,用非標(biāo)記定量軟件對(duì)由質(zhì)譜獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量分析,來(lái)研究突變的H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA是否能影響細(xì)胞增殖。研究目的1.驗(yàn)證突變的H2A/K假基因是有活性的2.證明突變的H2A/K假基因能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖研究方法1.腎癌組織H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA-cDNA的PCR分析取30毫克腎癌組織樣品,放入研缽中(液氮預(yù)冷)加入液氮研磨成粉末樣,加入1毫升的,混勻后轉(zhuǎn)入無(wú)RNA酶的1.5毫升EP離心管中,每管加入0.2毫升的氯仿,用振蕩器震蕩。以12000g在4℃離心機(jī)中離心15分鐘,取100微升上清轉(zhuǎn)入經(jīng)0.1%DEPC水處理的1.5毫升EP管中,加入100微升的異丙醇沉淀。純化后的RNA模板通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒和引物5’-GGGATCCATGCAGGGCAGCA-3'反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再用引物PF 5'-GGGATCCATGCAGGGCAGCA-3和引物PR5'-AGAATTCTCACTTGTATAGA-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增,之后亞克隆到PCDNA3.0質(zhì)粒上進(jìn)行測(cè)序。2.細(xì)胞培養(yǎng)、分子克隆和轉(zhuǎn)染人腎細(xì)胞HEK293T被培養(yǎng)在改良的培養(yǎng)基DMEM中,培養(yǎng)基另外添加4.5克／升的葡萄糖和10%熱滅活胎牛血清,在37℃含有5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。四個(gè)分別表達(dá)H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA(正常、C290T突變、C228A突變和A45G突變)質(zhì)粒,是由來(lái)源于健康人和腎癌病人的cDNAs連接到pCDNA3.0上所構(gòu)建。DNA轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑完成。簡(jiǎn)介步驟如下,質(zhì)粒DNA與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑以1微克／微升的比例,混合到無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中,室溫孵育15分鐘,加入到培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞融合度達(dá)到60-70%的培養(yǎng)皿中,質(zhì)粒在培養(yǎng)基中的最后濃度為8微克／毫升,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱在37℃培養(yǎng)48小時(shí)。3.蛋白提取四個(gè)分別表達(dá)H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA(正常、C290T突變、C228A突變和A45G突變)的質(zhì)粒,分別使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染人。腎HEK293T細(xì)胞(每組4個(gè)10厘米大培養(yǎng)皿細(xì)胞,4組共16個(gè)10厘米大培養(yǎng)皿細(xì)胞),培養(yǎng)48小時(shí)后,經(jīng)過(guò)PBS清洗的16個(gè)大培養(yǎng)皿中的細(xì)胞,分別被加入1毫升預(yù)冷帶有cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,用1毫升移液器完全吹打,然后分別把培養(yǎng)皿中細(xì)胞裂解混合液移入1.5毫升預(yù)冷的離心管中,放置冰上20分鐘裂解,然后放入4度離心機(jī)中以13500g離心30分鐘,取上清到新的預(yù)冷1.5毫升標(biāo)記好的離心管中,用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度。4.蛋白溶液內(nèi)胰酶酶解200微克的蛋白加入DTT到20mM摩爾濃度,置于56度還原30分鐘去掉二硫鍵,加入IAA到50mM摩爾濃度,避光置于26度20分鐘,保護(hù)已經(jīng)被還原的二硫鍵。之后以1：30質(zhì)量比加入質(zhì)譜測(cè)序級(jí)胰酶,37度酶解20小時(shí),然后用10k超濾管以15000g離心30分鐘,超濾酶解的蛋白獲得肽段,最后用ZipTip CJ18柱脫鹽純化肽段。5.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析肽段上樣前,每個(gè)樣品用20微升0.1%甲酸溶解。肽段是采用高壓液相色譜(HPLC, Thermo EASY-nLC System)分離,用電噴霧串聯(lián)離子井質(zhì)譜儀(Thermo LTQ Orbitrap Velos Elite, Thermo)測(cè)定肽段的質(zhì)荷比進(jìn)行分析鑒定。每一個(gè)肽段樣品分析時(shí),樣品先經(jīng)過(guò)碳18預(yù)分析柱,然后到碳18反相分析柱。肽段在碳18反相分析柱中用一個(gè)線性可溶梯度的液體(A相,0.1%甲酸水；B相,100%乙腈),以200納升/分鐘流速洗脫120分鐘。一級(jí)質(zhì)譜圖譜是在離子井分析儀中,以質(zhì)荷比300-1800范圍60,000精確度獲得,二級(jí)質(zhì)譜是以碰撞誘導(dǎo)解離(CID)模式進(jìn)行分析。對(duì)照組Q1以及三個(gè)突變組M_C290T、M_C228A和M_A45G的肽段樣品各分析四次。6.組蛋白h2a(無(wú)h2a/k)表達(dá)蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析來(lái)源于每個(gè)樣品的二級(jí)圖譜(CID)數(shù)據(jù),使用蛋白質(zhì)組分析軟件(Proteome Discoverer 1.4)以2013年01月03日SWISS-PROT中人的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),進(jìn)行蛋白搜索鑒定。7.應(yīng)用MaxQuant軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量分析對(duì)照組Q1以及突變組M_C290T, M_C228A和M_A45G的蛋白質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)(16個(gè)raw文件),通過(guò)著名MaxQuant(http://www.maxquant.org/)軟件進(jìn)行非標(biāo)記蛋白質(zhì)組定量分析,搜索的數(shù)據(jù)庫(kù)為2013年01月03日SWISS-PROT中人的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)數(shù)據(jù)通過(guò)Andromeda搜索引擎搜索。每組蛋白樣品定量分析基于四次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn),對(duì)照組Q1以及突變組M_C290T、M_C228A和M_A45G四組共16個(gè)樣品的蛋白定量,應(yīng)用Welch's t test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,當(dāng)Welch'st test p0.05時(shí)被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)蛋白表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)時(shí),突變組蛋白表達(dá)豐度與對(duì)照組中相應(yīng)蛋白表達(dá)豐度比值(Mutant/Q1)小于2倍的蛋白被拋棄。8.差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析MaxQuant軟件分析的對(duì)照組Q1以及突變組(M_C290T、M_C228A和M_A45G)組間差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù),通過(guò)著名的PANTHER(http://www.pantherdb.org/)基因聚類軟件分析,得到因H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA突變表達(dá)而調(diào)整細(xì)胞蛋白功能分類的分析結(jié)果；同樣,通過(guò)著名的STRING (http://www.string-db.org/)蛋白相互作用軟件分析,得到因H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA突變表達(dá)而調(diào)整的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果。9.蛋白PCNA的Western blot分析Western blot分析由分別轉(zhuǎn)染對(duì)照組Q1以及突變組M_C290T、M_C228A和M_A45G質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞提取的蛋白來(lái)完成。用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白,每個(gè)樣品各取50微克進(jìn)行上樣和SDS-PAGE凝膠電泳,然后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上,經(jīng)5%BSA封閉,孵育一抗,用PBS洗三遍后孵育二抗,用Odyssey掃膜儀掃膜和進(jìn)行灰度值分析。10.細(xì)胞增殖檢測(cè)HEK293T細(xì)胞以2500個(gè)細(xì)胞／孔的密度種植在24孔板上孵育過(guò)夜,然后按之前轉(zhuǎn)染步驟,按比例分別轉(zhuǎn)染對(duì)照組Q1以及突變組M_C290T、M_C228A和M A45G質(zhì)粒到各自3個(gè)孔的HEK293T細(xì)胞中,放入37度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用EdU細(xì)胞增殖試劑盒來(lái)完成。按照EdU細(xì)胞增殖試劑盒操作步驟,用EdU染新增殖的細(xì)胞(紅色)和用Hoechst 33342染全部細(xì)胞(藍(lán)色),然后在熒光倒置顯微鏡下觀察,使用Image-Pro Plus 6.0 (IPP 6.0)圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)字分析。11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Fisher's exact test統(tǒng)計(jì)方法,對(duì)10個(gè)腎腫瘤病人和12個(gè)健康人中的突變H2A/K lncRNA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,當(dāng)p0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；應(yīng)用Welch's t test統(tǒng)計(jì)方法對(duì)蛋白質(zhì)組定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,當(dāng)p0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他的定量分析應(yīng)用Student'sttest進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,當(dāng)p0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。定量數(shù)據(jù)由平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。研究結(jié)果1. H2A/K假基因能轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)非編碼RNAH2A/K假基因由于向5’端方向移碼一個(gè)堿基,出現(xiàn)了終止子提前而不能正常翻譯蛋白質(zhì),因而不是正常的組蛋白H2A基因。然而在一些腎癌組織樣品中,H2A/K轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)非編碼RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR測(cè)序后能夠被找到。2.細(xì)胞內(nèi)表達(dá)突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA分別轉(zhuǎn)染四種質(zhì)粒(表達(dá)正常H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA或突變的H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA:M_C290T、M_C228A或M_A45G)到HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,收集被轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞,然后通過(guò)RNA提取步驟提取總RNA,進(jìn)而對(duì)H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增,應(yīng)用引物‘'CATGGGAGACTACAAGGAC"對(duì)表達(dá)的H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA進(jìn)行測(cè)序。而在質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中,沒有發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(包括對(duì)照組和三個(gè)突變組)表達(dá)H2A/K蛋白。3.應(yīng)用Shotgun和MaxQuant蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA調(diào)整細(xì)胞蛋白表達(dá)對(duì)照組Q1和三個(gè)突變組M_C290T、M_C228A和M_A45G每組各四份肽段樣品,分別進(jìn)行串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜分析。由shotgun質(zhì)譜分析方法獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(raw文件),使用非標(biāo)記定量軟件MaxQuant進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量分析。在分別表達(dá)正常和突變的H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA各細(xì)胞組中,對(duì)照組Q1參與定量的蛋白數(shù)是403個(gè),突變組M_C290T參與定量的蛋白數(shù)是320個(gè),突變組M_C228A參與定量的蛋白數(shù)是259個(gè),突變組M_A45G參與定量的蛋白數(shù)是309個(gè)。在突變組和對(duì)照組之間,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)蛋白數(shù)如下(Welch's t test, p value0.05):對(duì)照組Q1有296個(gè),突變組M_C290T有193個(gè),突變組M_C228A有191個(gè)和突變組M_A45G有177個(gè)。在突變組中蛋白表達(dá)下調(diào)(大于2倍)蛋白數(shù)如下：突變組M_C290T有28個(gè)下調(diào),突變組M_c228A有29個(gè)下調(diào)和突變組M_A45G有37個(gè)下調(diào)。在突變組中蛋白表達(dá)上調(diào)(大于2倍)蛋白數(shù)如下：突變組M_C290T有147個(gè)上調(diào),突變組M_C228A有142個(gè)上調(diào)和突變組M_A45G有108個(gè)上調(diào)。4.基因聚類分析顯示突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA促進(jìn)細(xì)胞增殖在基因聚類分析中,H2A/K突變組中染色質(zhì)蛋白表達(dá)的調(diào)整,與長(zhǎng)非編碼RNA能誘導(dǎo)染色質(zhì)重塑的報(bào)導(dǎo)相一致。在三個(gè)突變組中,共同下調(diào)的染色質(zhì)結(jié)合蛋白是凝集素亞單位SA-2(STAG2),STAG2是有臨床意義的腫瘤抑制因子,這與一些長(zhǎng)非編碼RNA單核苷酸多態(tài)性參與腫瘤形成的之前發(fā)現(xiàn)相一致。同時(shí),在突變組中多數(shù)的轉(zhuǎn)錄因子、翻譯激活子和細(xì)胞增殖相互作用蛋白的表達(dá)上調(diào),而且根據(jù)基因聚類分析發(fā)現(xiàn),在突變組中,有非常多的參與生物合成、細(xì)胞運(yùn)輸、細(xì)胞過(guò)程和基礎(chǔ)代謝的蛋白表達(dá)都發(fā)生上調(diào)。根據(jù)這些分析,可以推測(cè)突變的H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA能促進(jìn)細(xì)胞增殖。5.三個(gè)H2A/K突變組中PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA促進(jìn)細(xì)胞增殖應(yīng)用相互作用基因搜索軟件Search Tool for the Retrieval of InteractingGenes (STRING) 9.0 database,對(duì)正常組Q1和突變組(M_C290T、M_C228A和M_A45G)之間差異表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析鑒定。這個(gè)蛋白相互作用通路分析揭示了一個(gè)以PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)為核心的PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),這個(gè)網(wǎng)絡(luò)顯示了與PCNA目互作用的許多上調(diào)蛋白之間有意義的相互聯(lián)系。其中讓人感興趣的一點(diǎn)是,突變組中大多數(shù)與PCNA相互作用的蛋白可以促進(jìn)腫瘤形成。四個(gè)表達(dá)上調(diào)的腫瘤形成蛋白,如PCNA、DNA結(jié)合蛋白A(CSDA)、熱休克同源71 kDa蛋白(HSPA8)和依賴ATP的RNA解旋酶(DDX17)在三個(gè)突變組PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中共同出現(xiàn)。9個(gè)腫瘤發(fā)生相關(guān)蛋白,如連環(huán)蛋白B 1(CTNNB1)、小泛素相關(guān)修飾蛋白2(SUM02)、核纖層蛋白-B1 (LMNB1).烯醇化酶1(ENO1)、78 kDa糖調(diào)節(jié)蛋白(HSPA5)、70 kDa熱休克蛋白1A(HSPA1A)、線粒體60 kDa熱休克蛋白(HSPD1)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)子BAX (BAX)和ATP依賴的RNA解旋酶A(DHX9),在2個(gè)H2A/K突變組PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中共同表達(dá)上調(diào)。有四個(gè)腫瘤相關(guān)蛋白,即磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、輸入蛋白亞單位-Q(KPNA2)、核仁素(NCL)和RNA結(jié)合蛋白FUS(FUS)的蛋白表達(dá),只在一個(gè)突變組PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)里被調(diào)整。通過(guò)STRING軟件對(duì)突變組PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)是以PCNA蛋白為核心,而且與PCNA相互作用的大多數(shù)表達(dá)調(diào)整的蛋白都與腫瘤發(fā)生相關(guān)。根據(jù)以上STRING生物信息軟件分析發(fā)現(xiàn),在三個(gè)突變組中,由突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA引起的PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。6. Western blotting確定PCNA蛋白在三個(gè)突變組(M_C290T、M_C228A和M_A45G)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)Western blotting分析是通過(guò)表達(dá)正�；蛲蛔僅2A/K長(zhǎng)非編碼RNA的對(duì)照組Q1和突變組(M_C290T、M_C228A和M_A45G)細(xì)胞提取的蛋白而完成。Western blotting的分析結(jié)果顯示,在表達(dá)突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA的突變組(M_C290T、 M_C228A和M A45G)細(xì)胞中,細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白PCNA表達(dá)上調(diào)。7.細(xì)胞增殖功能檢驗(yàn)顯示突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA(C290T/U、C228A和A45G)促進(jìn)細(xì)胞增殖按照EdU細(xì)胞增殖試劑盒(廣州銳博EdU細(xì)胞增殖Kit)操作步驟,用EdU染新增殖的細(xì)胞(紅色)和用Hoechst33342染全部細(xì)胞(藍(lán)色),然后在熒光倒置顯微鏡下觀察,使用Image-Pro Plus 6.0(IPP 6.0)圖像分析軟件進(jìn)行數(shù)字分析,細(xì)胞增殖率用EdU細(xì)胞染色水平與Hoechst 33342細(xì)胞染色水平的比值表示。對(duì)照組Q1細(xì)胞增殖比率是0.134±0.003；突變組M C290T細(xì)胞增殖比率是0.453±0.086；突變組M_C228A細(xì)胞增殖比率是0.398±0.092和突變組M_A45G細(xì)胞增殖比率是0.388±0.070。結(jié)果顯示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,應(yīng)用Student's t test檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,p值0.001(n=3),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞增殖功能檢驗(yàn)在細(xì)胞水平上也證明了突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA(C290T、C228A和A45G)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。討論1.突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)合蛋白和DEAD-box RNA解旋酶,增加細(xì)胞正常的轉(zhuǎn)錄活性從而促進(jìn)細(xì)胞過(guò)程和細(xì)胞增殖。2.H2A/K假基因雖然不能表達(dá)正常組蛋白,但可以轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)非編碼RNA。3.我們使用了比較成熟的shotgun質(zhì)譜分析方法和非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究突變H2A/K,分析結(jié)果顯示突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA上調(diào)了許多原癌基因和下調(diào)了一些腫瘤發(fā)生抑制因子。使用生物信息學(xué)的基因聚類分析發(fā)現(xiàn),突變的H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA上調(diào)許多轉(zhuǎn)錄激活子、翻譯激活子、生物合成過(guò)程蛋白和運(yùn)輸?shù)鞍?從而促進(jìn)細(xì)胞過(guò)程和細(xì)胞增殖。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn),在表達(dá)突變H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA的細(xì)胞組中,以PCNA為中心的PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)里,大多數(shù)上調(diào)蛋白是腫瘤發(fā)生相關(guān)基因,這些基因的調(diào)整有利于促進(jìn)細(xì)胞增殖。4.在定量蛋白質(zhì)組的分子水平上和細(xì)胞增殖檢測(cè)的細(xì)胞水平上,都證實(shí)了突變的H2A/K長(zhǎng)非編碼RNA(C290T、C228A和A45G)能促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)論1.H2A/K假基因有生物活性。2.在非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組分子水平和EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)的細(xì)胞水平,都證明突變的H2A/K(M_C290T、M_C228和M_A45G)能促進(jìn)細(xì)胞增殖
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q26
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本文編號(hào)：1462249