【摘要】：微藻生物柴油因環(huán)保、可再生、原料生長周期短等優(yōu)點成為研究的熱點。但天然微藻油脂含量低,且油脂提取成本高,嚴重影響了微藻生物柴油產業(yè)化的進程。利用基因工程手段調控油脂合成與代謝相關基因,對于提高微藻油脂含量、實現其脂肪酸分泌具有重要意義。�；o酶A合成酶(ACS)能活化生物體內的自由脂肪酸,進而廣泛參與油脂的合成與代謝反應。本研究從萊茵衣藻基因組數據庫中預測出兩個ACS基因,通過RT-PCR克隆其c DNA,并對其編碼蛋白進行序列分析與功能預測。采用酵母互補實驗研究其體外功能,確認其具有ACS活性。進一步構建了反義ACS基因的工程藻株,結合熒光定量PCR和GC-MS檢測,最終證實萊茵衣藻ACS參與了油脂代謝且促進了脂肪酸分泌。具體結果如下:利用生物信息學方法從萊茵衣藻基因組中預測出兩個ACS基因,首次克隆其c DNA,分別命名為cracs1和cracs2,其長度分別為2 004 bp和2 016 bp。對其編碼蛋白cr ACS1和cr ACS2分析發(fā)現,二者均包含ACS的兩個保守區(qū)域:AMP-binding區(qū)和FACS標簽。進化樹比對顯示cr ACS1和cr ACS2與擬南芥的長鏈ACSs具有較高的同源性,均為長鏈ACS。萊茵衣藻ACS在酵母YB525中表達檢測發(fā)現,cr ACS1和cr ACS2均能互補酵母YB525的ACS缺陷表型,可活化并利用外源脂肪酸。cr ACS1和cr ACS2均偏好活化長鏈脂肪酸,其中cr ACS1偏好C16:1和C18:1,cr ACS2偏好C16:0、C18:0、C16:1和C18:1。該結果表明cr ACS1和cr ACS2具有ACS活性,屬于�；o酶A合成酶家族。獲得了反義cracs1、cracs2基因的工程藻株q-15、p-13。熒光定量結果發(fā)現,q-15的cracs1表達量與cc849相比下降53.78%;p-13的cracs2表達量與cc849相比下降23.67%。此外,研究發(fā)現cracs1與cracs2的m RNA表達量之間存在關聯(lián)性,p-13中反義cracs2片段可促進cracs1的表達;而q-15中反義cracs1片段可導致cracs2表達量的下降。工程藻株q-15和p-13的脂肪酸分析結果顯示,細胞內總脂含量均明顯上升,同時都表現出明顯脂肪酸分泌現象。q-15和p-13的胞內總脂含量分別為130.1μg/mg、141.6μg/mg,與cc849相比分別上升45%和55%;q-15和p-13分泌的脂肪酸含量分別為13.413mg/109cells和16.89 mg/109cells。綜上所述,本研究首次克隆并探究了萊茵衣藻ACS的功能,成功利用其調控萊茵衣藻脂肪酸代謝。證明萊茵衣藻ACS不僅促進胞內脂肪酸的累積,且實現了脂肪酸的分泌。本研究不僅為ACS調控萊茵衣藻的油脂合成與代謝研究打下一定基礎,也為微藻生物柴油的發(fā)展提供一定的理論依據。
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生物柴油生產的簡易流程圖

圖 2 ACS 參與的代謝途徑[53]源脂肪酸的攝入 ②膜脂的流通 ③脂肪酸的從頭合成 ④三脂酰甘油和固醇的水解 ⑤脂類的合成OLE1 的抑制 ②誘導過氧化物酶基因表達 C：①參與囊泡運輸和細胞器合成 ②信號轉導與配 在生物體內發(fā)揮著重要的作用，參與多種代謝途徑（圖 2）。例如：脂肪、細胞信號轉導、細胞壁的合成、脂肪酸合成磷脂或三脂酰甘油，脂肪酸去飽和，蛋白的脂�；�，脂肪酸的降解包括α-、β-、w-氧化降解等這些過程[輔酶 A 合成酶調控脂肪酸的研究基輔酶 A 合成酶調控脂肪酸合成與代謝的研究 廣泛存在于各種生物，在脂肪酸的代謝途徑中具有重要作用。目前一些高、真菌和微藻的長鏈 ACS（LACS）家族基因已經被克隆和分析[54-59]。高物擬南芥含有 9 個 LACS 基因，其中 7 個能夠互補缺陷 ACS 的酵母表型和遺傳學研究表明，，其 LACS 活性與質體脂肪酸的合成[51]、活化[60]、角質肪酸的β-氧化[52]等有密切關系[62]。其中有關脂肪酸的合成與代謝方面的研
【學位授予單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q946.5;TE667

【參考文獻】

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本文編號：2518375