【摘要】：圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)是一株優(yōu)良的微生物油脂生產(chǎn)菌,在營(yíng)養(yǎng)限制條件下過量積累胞內(nèi)油脂;并可用于生產(chǎn)胞外多糖、β-類胡蘿卜素、工業(yè)用酶等,在生物制藥產(chǎn)業(yè)和環(huán)境治理方面中有廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí),圓紅冬孢酵母具有生長(zhǎng)周期短、利用碳源廣泛、油脂積累量多等優(yōu)點(diǎn),為生物柴油的能源發(fā)展戰(zhàn)略提供廉價(jià)原料。【目的】利用分子生物學(xué)手段和基因工程技術(shù),構(gòu)建圓紅冬孢酵母的誘導(dǎo)型遺傳操作平臺(tái)。【方法】通過生物信息學(xué)分析,以R.toruloides NP11基因組DNA為模板,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法進(jìn)行擴(kuò)增,分離葡萄糖阻遏型啟動(dòng)子Padh2(promoter of alcohol dehydrogenase gene)、半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pgal1(promoter of galactokinase)、磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Ppho89(promoter of sodium:inorganic phosphate symporter gene)和終止子Thsp、Tgpd基因片段,然后采用RF(restriction free)克隆方法替換原載體pZPK-pPGK-hyg-tNOS上的組成型啟動(dòng)子Ppgk和終止子Tnos,以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin phosphotransferase)基因?yàn)閳?bào)告基因,構(gòu)建了6種內(nèi)源性誘導(dǎo)型載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入單倍體R.toruloides NP11和二倍體R.toruloides Y4基因組中,獲得有潮霉素抗性的重組菌株,利用潮霉素抗性表型驗(yàn)證啟動(dòng)子和終止子的功能。在此基礎(chǔ)上引入多克隆位點(diǎn)MCS(multiple cloning site),以pZPK-pPGK-hyg-tNOS質(zhì)粒為基礎(chǔ),構(gòu)建3種雙表達(dá)盒誘導(dǎo)型MCS載體,并利用其表達(dá)蘋果酸酶(malic enzyme)基因。【結(jié)果】成功構(gòu)建了3種圓紅冬孢酵母誘導(dǎo)性表達(dá)載體,該載體在圓紅冬孢酵母中都可表現(xiàn)出啟動(dòng)子和終止子活性,初步了建立圓紅冬孢酵母誘導(dǎo)型操作平臺(tái),并成功表達(dá)了蘋果酸酶基因,為進(jìn)一步優(yōu)化或改變圓紅冬孢酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供便利的平臺(tái)。【結(jié)論】所分離的Ppho89啟動(dòng)子受磷酸鹽濃度的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)節(jié),Padh2和Pgal1啟動(dòng)子受葡萄糖濃度的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)節(jié),誘導(dǎo)響應(yīng)度高,操作簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)便捷,為后續(xù)圓紅冬孢酵母代謝工程研究提供了基本材料。本研究仍在繼續(xù)完善和優(yōu)化圓紅冬孢酵母表達(dá)系統(tǒng),希望構(gòu)建出更高效的表達(dá)載體,進(jìn)一步提高目的蛋白的表達(dá)量。
[Abstract]:The yeast (Rhodosporidium toruloides) is an excellent microorganism oil producing strain, which can accumulate intracellular oil excessively under the condition of nutrition restriction, and can be used to produce extracellular polysaccharides, 尾 -carotenoids, industrial enzymes and so on. It has a wide application prospect in biopharmaceutical industry and environmental governance. At the same time, Pichia cerevisiae has the advantages of short growth cycle, wide carbon source and abundant oil accumulation, which provides cheap raw materials for the energy development strategy of biodiesel. [objective] to utilize molecular biological methods and genetic engineering techniques. To construct the inducible genetic manipulation platform of Saccharomyces cerevisiae. [methods] by bioinformatics analysis, the genomic DNA of R.toruloides NP11 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) (polymerase chain reactions-PCR. The glucose repressor promoter Padh2 (promoter of alcohol dehydrogenase gene), galactose inducible promoter Pgal1 (promoter of galactokinase), phosphate hunger inducible promoter Ppho89 (promoter of sodium:inorganic phosphate symporter gene) and terminator TGPD gene were isolated. Then RF (restriction free) cloning method was used to replace the constitutive promoter Ppgk and Terminator on the original vector pZPK-pPGK-hyg-tNOS. Six endogenous inducible vectors were constructed using hygromycin phosphotransferase (hygromycin phosphotransferase) as the reporter gene. The recombinant strains with hygromycin resistance were obtained by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation into haploid R.toruloides NP11 and diploid R.toruloides Y4 genomes. The function of promoter and Terminator was verified by hygromycin resistance phenotype. On the basis of pZPK-pPGK-hyg-tNOS plasmid, three kinds of double expression box inducible MCS vectors were constructed by introducing polyclonal MCS (multiple cloning site),. The expression of malonase (malic enzyme) gene was used to construct three kinds of inducible expression vectors of Rhodozyme rotundii. All of the vectors showed promoter and Terminator activity in Rhodococcus cerevisiae. The inducible operating platform was established and the malonase gene was successfully expressed. It provides a convenient platform for further optimizing or changing the metabolic network and expression regulation network of Rhodococcus cerevisiae. [conclusion] the isolated Ppho89 promoters are rigorously regulated by phosphate concentration of Padh2 and Pgal1 promoters. The strict regulation of sugar concentration, The induction response is high, and the operation is simple, economical and convenient, which provides the basic materials for the further study on the metabolism of Rhodostasia cerevisiae. In order to construct a more efficient expression vector and to further improve the expression of the target protein, this study continues to perfect and optimize the yeast expression system of Aspergillus cerevisiae and hope to construct a more efficient expression vector.
【學(xué)位授予單位】：大連工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q93;TE667

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本文編號(hào)：2173634