本文關鍵詞：基于微小凹圖式的C17.2細胞三維聚集體形成及其電生物物理特性研究

  更多相關文章： 細胞聚集體 神經(jīng)干細胞 有限元分析 TMRM 靜息膜電位

【摘要】：細胞的體外培養(yǎng)是生命科學研究的基礎，而將細胞體外培養(yǎng)時的生長狀態(tài)調(diào)整到與體內(nèi)細胞類似的生長狀態(tài)是廣大科研工作者一致在努力追求的目標。體外三維培養(yǎng)是最理想的解決辦法。然而目前大部分的三維培養(yǎng)方法或多或少存在細胞生長均一性較差、結(jié)構(gòu)構(gòu)型不均勻、不利于進行光學檢測等問題。以微小凹結(jié)構(gòu)為代表的三維聚集體培養(yǎng)方法是近些年較多研究的新方法，能一定程度上克服上述問題。但目前此類方法還不能同時實現(xiàn)使細胞即能充分的進行養(yǎng)分交換又能與基底有一定的粘附，從而較為準確的還原體內(nèi)細胞的生長狀態(tài)。本研究將先解決這一問題，構(gòu)建一個基于細胞凹面剝離行為的C17.2神經(jīng)干細胞三維聚集體培養(yǎng)基底。 我們基于紫外光光刻技術和軟光刻技術制備了9種微小凹圖式結(jié)構(gòu)其中6種結(jié)構(gòu)為五連孔微小凹，使用材料為聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolicacid，PLGA)和聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)。與C17.2神經(jīng)干細胞的初步復合培養(yǎng)結(jié)果顯示，基底在經(jīng)過等離子氧蝕刻和多聚賴氨酸裱襯后，細胞接種后能快速進入微小凹，并能很好的在其上貼壁生長，而不同材質(zhì)的基底對細胞生長和分布的影響幾乎沒有差異。C17.2細胞在微小凹中以擴增條件培養(yǎng)2天后仍維持均一的干細胞特性，這初步說明基底拓撲形貌的變化不會使C17.2細胞發(fā)生分化。 利用延遲拍攝技術對同一微小凹內(nèi)細胞行為的觀察發(fā)現(xiàn)C17.2細胞接種后一開始逐漸貼壁，并相互連接成細胞串，隨著培養(yǎng)時間增加，細胞串將從微小凹側(cè)壁上剝落，并形成三維懸浮生長的細胞聚集體。利用掃描電鏡也觀察到類似的結(jié)果。CFSE熒光染色結(jié)果顯示大部分三維生長細胞位于微小凹中靠近小凹口的區(qū)域懸浮生長。通過Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)較小的孔徑和較窄的通道寬度有利于細胞聚集體的形成。結(jié)合細胞增殖統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D80-W20和D100-W20結(jié)構(gòu)的細胞倍增時間最短，同時這兩種結(jié)構(gòu)中細胞聚集體的形成率也最高。對F-actin和vinculin進行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，細胞未形成成熟的粘著斑，但骨架排布有一定的差異。 通過有限元方法對細胞串在微小凹側(cè)面上剝離行為的模擬，發(fā)現(xiàn)微小凹模型中的初始剝離發(fā)生時的預應力(Critical peeling prestress，CPP)遠小于平面模型中的CPP值，說明細胞在微小凹側(cè)壁上比在平面培養(yǎng)時更容易剝離下來。而6種不同微小凹之間的CPP差異并不明顯。通過對細胞瞬時彈性模量(Cell instantaneouselastic modulus，EC)和粘附層彈性模量(Adhesion interface elastic modulus，EA)這兩個參數(shù)進行全面考察，發(fā)現(xiàn)反應細胞剝離能力的PM/F(微小凹模型的CPP與平面模型的CPP的比值)與kC/A(EC與EA的比值)有較好的正相關性。 上述研究表明，結(jié)合細胞的凹面剝離行為，我們成功的構(gòu)建了一種可用于C17.2神經(jīng)干細胞三維化懸浮生長的培養(yǎng)基底。 本研究的另一方面將聚焦于評價不同生長狀態(tài)C17.2細胞的電生物物理特性上。靜息膜電位(Resting membrane potential，RMP)是細胞的一個重要的電生物物理指標，它對許多功能性的膜蛋白具有調(diào)節(jié)作用，從而實現(xiàn)電刺激信號到細胞內(nèi)化學信號的轉(zhuǎn)換，并進而影響細胞的增殖、分化、凋亡等。然而目前利用膜片鉗技術要實現(xiàn)對聚集體內(nèi)細胞的膜電位檢測存在困難，因此本研究將使用電勢熒光染料作為指示劑實現(xiàn)C17.2細胞膜電位的檢測，同時將改進現(xiàn)有該技術檢測精度不高的缺陷。由于細胞膜鈉鉀通透性比值(PNa/K)能一定程度反映出細胞膜上不同離子通道的發(fā)育程度，因此我們RMP檢測方法的基礎上對這個電生物物理指標進行檢測。 研究中我們首次將雙結(jié)合位點的擬合方法用于對細胞核區(qū)四甲基羅丹明甲酯(Tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM)非特異性吸附量的標定，對梯度高鉀去極化的C17.2細胞進行RMP檢測發(fā)現(xiàn)用TMRM法檢測到的膜電位值與用膜片鉗檢測到的值基本一致，這很好的證明了此方法的可靠性和準確性。同時在利用CoroNa進行了胞內(nèi)鈉離子濃度的檢測的基礎上，結(jié)合戈德曼(Goldman)方程對細胞膜鈉鉀通透性比值進行了計算。最后將建立的新方法與Loew建立的方法以及我們前期采用的方法進行了比較，結(jié)果顯示新方法比以往方法精度更高。 我們進而對不同生長狀態(tài)的C17.2細胞的電生物物理特性進行了考察。先對不同生長天數(shù)的C17.2細胞的RMP和PNa/K進行了檢測，在細胞接種前3天，細胞膜電位存在一個逐漸變負的過程。之后我們采用了五種分化方法對C17.2細胞進行分化，最終選擇了分化結(jié)果較為穩(wěn)定的利用多聚賴氨酸進行基底裱襯來誘導分化的方法。通過形態(tài)學和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)大部分細胞都已經(jīng)開始分化，，但還未完全分化成成熟的神經(jīng)元。進行的電生物物理檢測發(fā)現(xiàn)，C17.2細胞雖然已經(jīng)開始分化，但其RMP和PNa/K還沒有發(fā)生顯著變化。最后我們檢測了在D80-W40微小凹中的C17.2細胞的RMP和PNa/K，結(jié)果表明三維生長的C17.2細胞的RMP比平面生長的細胞要更正，PNa/K也要更高。 在上一部分的研究中我們首次利用雙結(jié)合位點的擬合方法提高了基于TMRM的電位檢測精度，并實現(xiàn)了不同生長狀態(tài)的C17.2細胞的電生物物理特性的評價。 綜上，本研究中我們制備了一種連孔微小凹基底，生長于其中的C17.2神經(jīng)干細胞將自組裝成懸浮生長的三維細胞聚集體。這將為體外研究神經(jīng)干細胞的增殖、分化等行為提供一個很好的平臺，同時還可用于基于細胞的生物傳感器領域。本研究中我們還建立了一種具有較高精度的非侵入性的細胞靜息膜電位和鈉鉀離子通透性比值的檢測方法，這將彌補膜片鉗技術的一些不足。在此基礎上對C17.2神經(jīng)干細胞的不同狀態(tài)的電生物物理特性研究對認識神經(jīng)干細胞的生長發(fā)育過程具有重要意義。
【關鍵詞】：細胞聚集體 神經(jīng)干細胞 有限元分析 TMRM 靜息膜電位
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-9
• 目錄9-11
• 主要縮略詞11-12
• 1 緒論12-30
• 1.1 問題的提出及研究意義12-15
• 1.1.1 構(gòu)建用于神經(jīng)干細胞體外三維培養(yǎng)的陣列基底12-13
• 1.1.2 基于 TMRM 的細胞電生物物理評價方法13-15
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀15-26
• 1.2.1 基于 MEMS 的細胞體外培養(yǎng)技術的研究現(xiàn)狀15-17
• 1.2.2 凹形結(jié)構(gòu)在細胞培養(yǎng)中的應用及細胞在其中的生長行為分析17-20
• 1.2.3 細胞力學模型的研究進展20-23
• 1.2.4 基于 TMRM 的電位檢測方法的研究現(xiàn)狀23-26
• 1.3 本文研究的目的和研究內(nèi)容26-30
• 1.3.1 本文研究的目的26
• 1.3.2 本文研究的主要內(nèi)容26-27
• 1.3.3 本文研究的創(chuàng)新點27-30
• 2 微小凹圖式的制備及與 C17.2 細胞的初步復合30-44
• 2.1 引言30-31
• 2.2 實驗材料與方法31-35
• 2.2.1 實驗試劑與儀器31-32
• 2.2.2 實驗方法32-35
• 2.3 結(jié)果與討論35-41
• 2.3.1 硅主模和 PDMS 模具的加工35-36
• 2.3.2 微小凹圖式基底的制備36-37
• 2.3.3 微小凹圖式表面的親水化處理及表征37-39
• 2.3.4 C17.2 細胞與不同材料微小凹圖式的初步復合39-40
• 2.3.5 細胞在微小凹中的干細胞特性考察40-41
• 2.4 小結(jié)41-44
• 3 微小凹內(nèi)三維細胞聚集體的形成44-60
• 3.1 引言44-45
• 3.2 實驗材料與方法45-47
• 3.2.1 實驗試劑與儀器45
• 3.2.2 實驗方法45-47
• 3.3 結(jié)果與討論47-59
• 3.3.1 C17.2 細胞在微小凹中形成三維細胞聚集體的過程47-51
• 3.3.2 C17.2 細胞在微小凹中的增殖統(tǒng)計51-53
• 3.3.3 微小凹中細胞聚集體形成過程的熒光染色及統(tǒng)計分析53-58
• 3.3.4 C17.2 細胞的骨架和粘著斑蛋白染色58-59
• 3.4 小結(jié)59-60
• 4 細胞凹面剝離行為的有限元模擬60-80
• 4.1 引言60-61
• 4.2 實驗材料與方法61-66
• 4.2.1 實驗方法61-66
• 4.3 結(jié)果與討論66-77
• 4.3.1 連孔微小凹模型與平面模型的有限元模擬66-70
• 4.3.2 影響細胞剝離的力學參數(shù)70-75
• 4.3.3 不同細胞在凹面中的剝離能力75-77
• 4.4 小結(jié)77-80
• 5 基于 TMRM 的細胞電生物物理評價體系的建立80-100
• 5.1 引言80-81
• 5.2 實驗材料與方法81-86
• 5.2.1 實驗試劑與儀器81
• 5.2.2 實驗方法81-86
• 5.3 結(jié)果與討論86-98
• 5.3.1 TMRM 熒光強度的線性標定86-87
• 5.3.2 TMRM 檢測參數(shù)的確立87-89
• 5.3.3 TMRM 染料的熒光紅移分析89-90
• 5.3.4 TMRM 非特異性吸附的標定90-91
• 5.3.5 梯度去極化時 RMP 檢測及膜片鉗驗證91-92
• 5.3.6 胞內(nèi)鈉離子濃度的檢測方法的建立92-94
• 5.3.7 鈉鉀通透性比值檢測方法的建立94-96
• 5.3.8 與 Loew 的方法和課題組前期的方法進行對比96-98
• 5.4 小結(jié)98-100
• 6 C17.2 細胞在不同生長狀態(tài)中的電生物物理特性100-114
• 6.1 引言100
• 6.2 實驗材料與方法100-104
• 6.2.1 實驗試劑與儀器100-102
• 6.2.2 實驗方法102-104
• 6.3 結(jié)果與討論104-112
• 6.3.1 不同培養(yǎng)天數(shù)的 C17.2 細胞的電生物物理評價104-105
• 6.3.2 C17.2 細胞的分化及其電生物物理評價105-110
• 6.3.3 三維化生長的細胞的電生物物理評價110-112
• 6.4 小結(jié)112-114
• 7 結(jié)論與展望114-118
• 7.1 主要結(jié)論114-115
• 7.2 后續(xù)研究工作的展望115-118
• 致謝118-120
• 參考文獻120-134
• 附錄134
• A. 作者在攻讀博士學位期間發(fā)表的論文目錄134
• B. 作者在攻讀博士學位期間取得的科研成果目錄134
• C. 作者在攻讀博士學位期間參加的科研項目134

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張利光;吳澤志;宋兆全;黃豈平;廖彥劍;;三維微小凹圖式的制備及其與C17.2神經(jīng)干細胞的復合[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2012年03期

本文編號：780608